Nat Methods | 克服PCR扩增误差：利用同源三聚体核苷酸提高测序数据质量

独特分子标识符（UMI）的设计与合成

UMI的基本原理及其在序列分析中的应用

独特分子标识符（UMI）是一串能够唯一标记单个分子的随机序列，它使得科研人员能够在高通量测序过程中区分和量化每一个原始分子，即使在经过PCR扩增之后。这一技术极大地提高了测序数据的准确性，使得从单细胞测序到复杂样本分析的各种应用都变得更加可靠和精确。

采用同源三聚体核苷酸块设计UMI

为了进一步降低PCR扩增过程中引入的错误，该研究采用了一种创新的UMI设计策略——同源三聚体核苷酸块。这种设计利用了三个连续相同的核苷酸作为UMI的基本单位，以增强UMI在测序和数据分析过程中的稳定性和可辨识度。同源三聚体的结构设计不仅能够有效减少由于PCR或测序错误导致的误识别，还可以通过简化错误校正算法来提高数据处理的效率。

使用基于同源三聚体UMI的方法提高大规模mRNA测序的准确性，以减少PCR引起的错误（Credit: Nature methods）

合成方法与实验验证

该研究中UMI的合成采用了固相合成技术，通过精确控制化学合成过程，确保了UMI序列的高度一致性和纯度。合成完成的UMI经过一系列的生物化学实验进行验证，包括PCR扩增稳定性测试、测序准确性分析以及与传统UMI设计的比较实验。结果表明，采用同源三聚体核苷酸块设计的UMI在减少PCR扩增错误、提高测序数据准确性方面表现优异，验证了这一设计策略的有效性和应用潜力。

PCR扩增错误的检测与校正

PCR错误类型及其对UMI准确性的影响

在高通量测序技术中，PCR扩增是不可避免的步骤，其目的是增加样本的数量以满足测序需求。然而，PCR扩增过程中容易引入错误，包括错配、插入和缺失等，这些错误会直接影响到UMI的准确性和测序结果的可靠性。特别是在需要高度精确的单细胞测序和低丰度样本分析中，PCR错误的影响尤为显著。

同源三聚体UMI的错误检测方法

为了有效检测和减少PCR引入的错误，该研究采用了同源三聚体UMI设计。这种方法基于一个简单的原理：通过分析三聚体内的同质性，可以有效地识别和校正那些由PCR引起的随机错误。具体来说，如果在一个三聚体内出现两个或三个相同的核苷酸，则可以认为该位置没有错误，或者错误已被自然校正。如果三个核苷酸全不相同，则该位置很可能发生了PCR错误，需要进一步的校正处理。

错误校正策略与效率评估

针对检测到的错误，该研究开发了一套高效的错误校正策略。这套策略包括两个关键步骤：首先，对于每个UMI，通过比较其所有可能的三聚体组合，识别出错误最少的序列作为正确的UMI序列；其次，利用这个正确的UMI序列来替换原始数据中所有相应的错误UMI，从而实现错误的校正。通过这种方式，不仅能够有效降低由PCR错误引入的假阳性率，还能够显著提高数据分析的准确性和可靠性。

该研究中，错误校正的效率通过一系列实验进行了评估。实验结果显示，采用同源三聚体UMI的错误检测与校正策略，相比传统UMI设计，能够更有效地减少PCR错误，提高UMI的准确性。这一发现对于提升高通量测序数据的质量具有重要意义，尤其是在那些对数据准确性要求极高的应用场景中。

在批量和单细胞测序数据中应用UMI

批量测序数据中UMI的应用

在批量测序领域，独特分子标识符（UMI）的引入极大地提高了数据的准确性和可重复性。通过为每个分子赋予一个独一无二的标识，UMI允许研究人员精确区分和量化每一份复制的分子，从而有效减少PCR扩增过程中的偏差和错误。这一技术特别适用于需要高通量分析的复杂样本，如全基因组测序、转录组测序和表观遗传学研究等，为数据的解读提供了更高的准确性和信度。

单细胞测序数据中UMI的应用

单细胞测序技术因其能够揭示细胞间的异质性而变得日益重要。在这一领域中，UMI的应用尤为关键，它能够帮助研究人员追踪每一个单独的分子，确保即使在极少量的样本中也能获得高度准确的数据。通过使用UMI，单细胞测序能够揭示细胞的基因表达模式、变异和基因组结构的微小差异，为细胞功能研究和疾病机理研究提供了极其宝贵的信息。

同源三聚体UMIs在单细胞测序中提高差异表达的准确性（Credit: Nature methods）

测序平台对UMI准确性的影响

UMI的设计和应用效果受到测序平台特性的影响。不同的测序技术，如Illumina、PacBio和Oxford Nanopore等，因其独特的测序原理和数据输出特性，对UMI的准确性和应用效果有着不同的要求和影响。因此，针对不同测序平台优化UMI的设计和数据处理流程是实现高准确度测序的关键。该研究在Illumina、PacBio和Oxford Nanopore等不同测序平台上进行了广泛测试。结果显示，无论是短读序列还是长读序列的测序平台，同源三聚体UMI设计均能提供高度一致和准确的数据。特别是在长读序列测序中，同源三聚体UMI的优势更为明显，能够有效克服长读序列固有的高错误率问题，提高测序结果的可信度。

UMI技术的改进和优化仍有广阔的空间。未来的研究可能还可以从以下几个方面进行探索：首先，进一步优化UMI的设计，包括探索不同的核苷酸块组合和长度，以适应更广泛的测序应用需求；其次，开发更高效的错误检测和校正算法，提高数据处理的速度和准确性；最后，加强UMI技术与各种测序平台的兼容性研究，确保其在不同测序环境下的稳定性和可靠性。