Nature Biotechnology：微生物世界的“隐形”居民普查——SingleM与Sandpiper揭开的未知之谜

旧时代的困境：为何寻找新微生物如此之难？

在深入了解这场变革之前，我们要先理解“旧侦探们”的困境。传统的宏基因组分析工具，在鉴定样本中的微生物“居民”时，通常采用一种“通缉令”式的比对方法。研究人员手握一本厚厚的“已知罪犯档案”（即公共基因组数据库），将从环境中收集到的基因序列碎片（即现场找到的“蛛丝马迹”）与档案进行比对。对上了，就能确定“罪犯”身份；对不上，就只能无奈地将其归为“无法识别的线索”。

这种方法的弊端显而易见。地球上的微生物绝大多数都是“良民”，它们从未被单独分离、培养和测序，自然也就不在那本“罪犯档案”里。因此，当研究人员分析一个来自原始森林土壤的样本时，可能会发现高达90%的基因序列都无法匹配到任何已知微生物。这些序列并非没有价值，它们恰恰代表了这片土地上最真实、最独特的微生物群落，但在传统工具的视野里，它们成了被丢弃的“废料”。

这种“认知偏见”不仅让我们低估了地球的微生物多样性，更阻碍了我们理解生态系统的运作方式。那些未知的微生物可能正在默默地分解污染物、调节气候、或者生产着有待我们发现的天然药物。找不到它们，就如同一个侦探无视了案发现场90%的线索，破案的希望自然渺茫。

新时代的工具箱：SingleM的巧妙破案三部曲

为了打破这一困局，研究人员开发了一款名为“SingleM”的软件。它不像旧时代的侦探那样死板地依赖“通缉令”，而是采用了一套更聪明、更灵活的破案逻辑。我们可以将其巧妙的设计拆解为“破案三部曲”。

第一步：不看全脸，只看“通用特征”
SingleM的第一个高明之处，在于它放弃了对整个基因组进行大海捞针式的比对。相反，它选择了一套“通用身份证”，即59个在细菌和古菌中普遍存在的“单拷贝标记基因 (single-copy marker genes)”。这些基因就像所有人都拥有的鼻子、眼睛一样，是生命的基础构件，虽然在不同物种间形态各异，但其基本功能和结构是高度保守的。通过聚焦于这些标记基因，SingleM极大地提高了搜索效率。

第二步：从“语言”而非“文字”层面进行比对
这是SingleM最核心的创新之一。传统的工具通常在DNA（核苷酸）层面进行序列比对，而SingleM则更进一步，它将DNA序列翻译成蛋白质（氨基酸）序列再进行比对。在漫长的进化过程中，即使DNA的“拼写”因为突变而改变，但为了维持关键功能，蛋白质的“语义”往往被保守下来。SingleM通过在氨基酸层面进行比对，能够识别出那些在DNA层面看似“远亲”，但在功能和进化关系上实则“近邻”的物种。

第三步：先聚类，后定罪——无偏见的“嫌疑人”分组
在找到所有包含“通用特征”的基因片段后，SingleM并不会立刻去查“通缉令”。它做了一件非常巧妙的事：它将样本中所有这些片段进行“从头聚类 (de novo clustering)”。这意味着它会根据这些片段自身的相似性，将它们分成不同的小组，每一组代表一个“操作分类单元 (Operational Taxonomic Unit, OTU)”，可以理解为一个待定的物种。这个“先聚类、后鉴定”的策略，从根本上避免了参考数据库的偏见。

SingleM与旧时代侦探的实力较量

一个新工具好不好，不能只靠理论说，必须拉到“演武场”上比一比。研究人员设计了一系列严苛的基准测试，让SingleM与MetaPhlAn、Kraken2等主流的传统工具同台竞技。

首先，在模拟的、仅包含已知物种的群落中，SingleM的表现与最优秀的传统工具不相上下。但更亮眼的是它的效率。在处理相同的数据时，SingleM的运行时间仅为MetaPhlAn的12%，而所需的内存（RAM）更是只有2GB，远低于Kraken2+Bracken工作流程惊人的295GB。

真正的考验在于识别未知物种的能力。结果令人震撼。在衡量群落整体组成差异的“布雷-柯蒂斯相异度 (Bray-Curtis dissimilarity)”指标上（0代表完全一致，1代表完全不同），SingleM的表现遥遥领先。当群落中包含从新的门到新的科等不同级别的未知谱系时，SingleM的平均相异度得分仅为0.13，而其他工具的平均分则高达0.46。

在更极端的测试中，当一个群落100%由新物种构成时，SingleM的优势被进一步放大。它的F₁分数（一个综合了准确率和召回率的指标）比表现次之的工具高出了整整0.45。这充分证明，SingleM拥有在“一片黑暗”中独立描绘出微生物群落轮廓的非凡能力。

宏伟的普查：Sandpiper揭示地球微生物组的真实面貌

拥有了SingleM这把“神兵利器”，研究人员做了一件更大胆、也更有意义的事：他们发起了一场有史以来最大规模的全球微生物普查。他们创建了一个名为“Sandpiper”的网站（ https://sandpiper.qut.edu.au ），并利用云计算的强大算力，用SingleM分析了来自全球公共数据库中的248,559份宏基因组样本，总数据量高达1.3 Pbp（130亿亿个碱基对）。

惊人发现：我们身边的“陌生人”远比想象中多
普查最惊人的发现是，地球上的微生物世界，绝大部分都是由我们不认识的“陌生人”主导的。在人类肠道样本中，平均约有78%的微生物群落可以被鉴定到已知物种。然而，一旦将目光投向外部环境，景象就完全不同了。在土壤样本中，平均只有14%的微生物群落属于已知物种，中位数更是低至8%。这意味着，你随手抓起一把泥土，里面90%以上的微生物物种，在现有的基因组“名人录”上都找不到档案。

近年来，通过大规模的基因组挖掘工作，研究人员为参考数据库增加了超过82,000个新的物种谱系，几乎将数据库的规模翻了一番。然而，如此巨大的努力，仅仅将环境样本中已知物种比例的中位数提高了5.1%。

这个数字说明，我们已知的微生物世界，与那片广阔的未知海洋相比，不过是沧海一粟。我们对多样性的探索，才刚刚开始。

时间的维度：我们追赶未知的速度有多快？
Sandpiper的数据还让我们能够从时间的维度，审视我们对微生物世界的探索进程。结果显示，对于人类肠道等宿主相关环境，自2012年以来，每年新测序样本中超过50%的微生物都已经是“老熟人”了。然而，对于土壤、海洋等“生态环境”的样本，虽然已知物种的比例也在缓慢爬升，但其增长速度远远落后。

从地图到藏宝图：将新知识转化为新发现

Sandpiper不仅是一份静态的微生物世界地图，它更是一张动态的、可以指导未来探索的“藏宝图”。为了证明这一点，研究人员将目标锁定在细菌界中几个非常古老且罕见的谱系上，例如Muirbacteria和Wallbacteria。

传统的做法可能是在成千上万的样本中进行盲目的、昂贵的筛选和测序。但现在，研究人员可以直接在Sandpiper的“地图”上查询：在这24万多个样本中，哪些样本最有可能富含这些稀有谱系？

Sandpiper迅速给出了答案。研究人员根据预测，从63份候选样本中进行了靶向的基因组恢复工作，最终成功地从其中的55份样本（成功率高达87%）中，拼凑出了62个高质量的、全新的微生物基因组。这些新基因组全部属于新的物种，甚至包含了来自这四个稀有门的新属。这个案例完美地展示了SingleM和Sandpiper的强大威力，它将微生物的探索，从“大海捞针”式的机遇战，转变为“按图索骥”式的精准打击。

开启微生物探索的新篇章

SingleM和Sandpiper的问世，标志着微生物生态学研究进入了一个新时代。它从根本上解决了宏基因组学领域一个长期存在的“阿喀琉斯之踵”——对未知物种的系统性忽视。

SingleM以其巧妙的设计，为我们提供了一双能够穿透“未知”迷雾的慧眼。而Sandpiper则将这种能力放大到了全球尺度，它为我们呈现了一幅迄今为止最全面、最无偏见的地球微生物分布图。这张图不仅揭示了未知微生物世界的浩瀚，更指明了未来探索的方向。

这场由SingleM和Sandpiper引领的微生物“隐形居民”大普查，其意义远不止于编撰一份更完整的“生命名录”。那些占主导地位的未知微生物，它们的基因组中蕴藏着无法估量的生物学宝藏——全新的代谢途径、强大的环境适应能力、以及可能用于医药和工业的天然产物。

过去，我们站在宝库门外，却因没有钥匙而不得其门而入。现在，SingleM为我们锻造了钥匙，Sandpiper则绘制了通往宝库的地图。这场激动人心的微生物世界大探索，才刚刚拉开序幕。