复旦大学应天雷/林金钟组首次探索慢性乙肝的mRNA新疗法

乙型肝炎是由于感染乙肝病毒（HBV）引起的最常见的严重肝脏疾病。大部分成年人感染HBV以后，很少或者几乎没有症状，依靠自身免疫系统清除HBV，这一过程需要长达6个月的时间，称为HBV急性感染。大部分婴儿或者幼童，感染HBV后，无法抵抗病毒复制，会产生HBV慢性持续感染，发展为慢性乙肝。

目前，全球有2.57亿HBV慢性感染者。HBV高水平复制会显著改变慢性乙肝患者体内的抗体多样性，造成功能缺陷性的T细胞和B细胞，引起持久性的HBV感染，发展为肝硬化，最终导致肝脏功能的丧失和肝癌。受损的宿主免疫系统和持续存在的cccDNA是HBV难以清除的主要障碍，使得无法彻底治愈乙肝。慢性乙型肝炎功能性治愈的显著特征是血清中检测不到HBsAg，这也是当前慢性乙型肝炎治疗的主要目标。目前，治疗慢性乙肝的药物，例如核苷类似物，聚乙二醇干扰素，在慢性乙肝病毒感染者中实现不到10%的功能性治愈。

复旦大学闻玉梅院士提出治疗慢性乙肝的“三明治”疗法：通过联合使用抗病毒药物和中和性单克隆抗体来创造出短暂清除血清HBV DNA和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的窗口期，紧接着使用HBV治疗性疫苗诱导机体产生有效的免疫应答，清除感染HBV的肝脏细胞，从而实现慢性乙肝感染的功能性治愈。

2019年，复旦大学应天雷等在 eBioMedicine 发表论文，在慢性乙肝小鼠模型中，证实抗HBsAg中和单克隆抗体G12与抗病毒药物联合使用可以将血清HBsAg减少到可以忽略不计的水平。但是，anti-HBsAg只能在非常有限的时间内中和消除乙肝病毒表面抗原。

抗体疗法已经逐渐成为治疗癌症，感染性疾病，自身免疫性疾病以及代谢疾病的首要治疗手段。然而，抗体的生产是一个非常复杂，耗时，昂贵的工程，这极大地限制了抗体疗法在传染病领域的普及应用。mRNA技术本身的免疫优势和简化的合成生产工艺使得其在病毒类疫苗的研发生产中具有得天独厚的优势。但是，目前，仅仅有非常少数的案例将mRNA技术应用于被动免疫，生产单克隆抗体。

2021年，有研究利用mRNA技术编码靶向基孔肯雅病毒（Chikungunya virus）的中和性抗体，临床1期数据证实此种方法的有效性。这是首次利用mRNA技术来研发单克隆中和抗体的临床试验。

近日，复旦大学应天雷课题组与林金钟课题组合作在 mBio 期刊发表了题为：A Single Dose of Anti-HBsAg Antibody-Encoding mRNA-LNPs Suppressed HBsAg Expression: a Potential Cure of Chronic Hepatitis B Virus Infection 的研究论文。

该研究首次利用mRNA技术编码乙肝病毒表面抗原抗体，在慢性乙肝小鼠模型中注射一剂G12-mRNA-LNP诱导产生的对血清乙肝表面抗原的清除能力可持续至少30天，从而显著减少血清乙肝表面抗原水平。

与此形成鲜明对比的是，外源单克隆抗体在注射9天后就会丧失对血清乙肝表面抗原的清除抑制作用。这项工作获得的初步数据表明通过编码乙肝表面抗原的mRNA-LNP来治愈慢性乙肝是一种非常有前景的新疗法。

G12-mRNA序列设计

研究人员在这项工作中采用的anti-HBsAg是G12，分别设计出4种不同类型的候选mRNA序列：G12-scFv-mRNA表达G12-scFv；G12-scFv-Fc-mRNA表达G12-scFv，G12 HC-mRNA 和G12 LC-mRNA按照比例混合用来表达G12-IgG。G12-scFv mRNA和G12-scFv-Fc mRNA在293T细胞中的表达水平存在明显的剂量效应。当G12 LC mRNA 和G12 HC mRNA两者的比例达到1：2时，G12-IgG在293T细胞中的表达水平可达到最高。

以6.7mg/kg剂量向C57小鼠静脉注射三种类型的G12单抗：G12-scFv，G12-scFv-Fc，G12-IgG。在注射单抗15min后，血清中的抗体浓度就可以达到最大值。在随后的时间里，血清中抗体水平随着时间急剧下降。相反，以2.5mg/kg剂量向C57小鼠静脉注射三种类型的G12-mRNA，可以看到G12蛋白的表达会出现一个逐渐积累，持续表达的时间段，而且，血清中G12抗体浓度维系高水平的持续时间超过8h。不管注射LNP还是直接注射抗体，血清中G12-scFv的浓度均是最低的，这说明血清中的G12-scFv很快会被清除掉。向小鼠直接注射抗体时，血清中G12-IgG浓度是最高的，而向小鼠注射LNP时，血清中的G12-scFv-Fc浓度是最高的，维系最高浓度的时间将近8h。

AAV/HBV小鼠模型可以持续性表达HBsAg，研究人员通过静脉注射3种类型的G12-mRNA-LNP或者以及其对应的G12抗体，比较注射后，对小鼠血清HBsAg降低程度：

不管是注射G12-scFv-mRNA-LNP，还是直接注射G12-scFv抗体对于血清HBsAg的中和抑制程度均没有出现显著效果。这可能与G12-scFv-mRNA-LNP在细胞中低水平的表达或者G12-scFv抗体在血清中被快速清除有关。

当直接注射G12-scFv-Fc抗体时，仅仅在注射后5天以内具有明显的血清HBsAg清除效果，但是，注射G12-scFv-Fc-mRNA-LNP后，对于血清HBsAg的清除效果却可以持续较长的时间。比较奇怪的是，注射G12-scFv-Fc mRNA-LNP或者抗体后血清HBsAg会立即出现急剧下降，在注射后第5天血清HBsAg开始反弹，到第十天时，血清HBsA浓度达到顶点。如果注射G12-scFv-Fc mRNA-LNP，在注射第10天以后血清HBsAg又开始发生下降，一直到第20天血清HBsAg下降到一个稳定的浓度。总的来说，注射G12-scFv-Fc-mRNA-LNP要比直接注射其对应的抗体具有更加持久的血清HBsAg清除效应。尽管直接注射G12-scFv-Fc抗体要比注射mRNA-LNP产生的血清G12-scFv-Fc浓度更高，但是，注射mRNA-LNP具有更加持久的血清HBsAg清除能力，产生这种矛盾的原因需要更进一部分探索。

注射G12-IgG-mRNA-LNP对于血清HBsAg的清除需要一段时间才能显现出来，但是，这种清除效果是逐渐增强的，可持续到30天。相反，直接注射G12-IgG骤降血清HBsAg浓度，但是，血清HBsAg很快会发生反弹。注射G12抗体可以产生更高浓度的血清G12-IgG，然而，注射G12-IgG-mRNA-LNP对于血清HBsAg会有一个更加持久的清除能力。

结论

清除血清HBsAg一直被视作是抗HBV治疗的长期目标。anti-HBsAg在慢性乙肝功能性治疗中可以直接抑制血清中的HBsAG。这项工作利用mRNA技术首次表达anti-HBsAg IgG，并且在小鼠模型中，证实注射编码anti-HBsAg IgG的mRNA-LNP要比直接注射对应的抗体更加具有持久显著的血清HBsAg清除能力。这表明mRNA分子和脂质体成分触发的佐剂效应可能对于血清HBsAg 清除能力是有增强效果的。

LNP将mRNA主要递送到肝脏细胞中，这使得mRNA-LNP技术成为肝脏疾病的非常理想的治疗平台。相比于繁琐耗时昂贵的的单抗生产工艺，mRNA生产工艺更加快速便捷通用。在慢性乙肝“三明治”疗法中，用编码乙肝表面抗原抗体的mRNA-LNP替代对应的单抗，在将来会成为一种非常有前景的新疗法。