Nature Methods | 解码RNA与蛋白质相互作用的新视角：TREX技术的突破

TREX（Targeted RNase H-mediated Extraction）技术，是一种创新的生物技术，旨在精确识别和分析活细胞中特定RNA区域与RNA结合蛋白（RBPs）之间的相互作用。该技术通过利用RNase H酶的特异性降解能力，配合定制的DNA探针精准靶向RNA序列，实现对特定RNA区域结合蛋白的有效提取和鉴定。此过程中，DNA探针与目标RNA形成DNA/RNA杂交复合体，RNase H酶识别这些复合体并特异性降解RNA链，从而释放与RNA直接相互作用的蛋白质，以供后续的质谱分析。

TREX与现有技术的比较

与传统的RNA-蛋白质相互作用分析技术相比，如RIP（RNA免疫沉淀）和CLIP（交联免疫沉淀）等，TREX技术在几个关键方面展现出显著优势：

特异性高：TREX技术通过特定的DNA探针直接靶向RNA序列，避免了非特异性背景的干扰，提高了实验的特异性和准确性。

灵敏度高：利用RNase H酶的高效率降解机制，TREX能够从大量非特异性蛋白中准确地提取出少量的特定RNA结合蛋白，显著提高了检测的灵敏度。

操作简便：相较于需要复杂交联和免疫沉淀步骤的传统方法，TREX技术流程简洁，操作便捷，大大降低了实验的操作难度和时间成本。

TREX在U1 snRNA和NORAD长非编码RNA上的应用

TREX技术已成功应用于多个关键的生物学研究中，其中包括对U1 snRNA和NORAD长非编码RNA（lncRNA）的结合蛋白进行的深入分析。

U1 snRNA：通过TREX技术，研究人员能够精确识别出与U1 snRNA特定区域相互作用的多个RNA结合蛋白，这些发现为理解U1 snRNA在剪接体组装和剪接调控中的作用提供了新的线索。

NORAD lncRNA：利用TREX技术，研究人员揭示了NORAD lncRNA与其结合蛋白之间的复杂互作网络，这对于探究NORAD在维持基因组稳定性中的功能具有重要意义。

TREX技术揭示的RNA与蛋白质的相互作用

45S rRNA的区域性互作组织图谱

TREX技术在揭示45S rRNA与RNA结合蛋白（RBPs）之间相互作用的研究中，展现出了前所未有的精确度和深度。通过精细的区域性分析，研究人员成功构建了45S rRNA的区域性互作组织图谱，这一成就不仅加深了我们对rRNA加工和成熟过程中蛋白质参与的理解，也为研究rRNA在疾病中的角色提供了重要的基础数据。

首次明确区分了与45S rRNA各个区域特异性结合的RBPs，揭示了复杂的蛋白质-RNA相互作用网络。通过对特定区域RBPs的功能分析，进一步阐释了这些蛋白质在rRNA加工、成熟及其调控中的作用。

针对特定RNA区域的RBPs的鉴定

利用TREX技术，研究人员能够精确鉴定出与特定RNA区域结合的RBPs。这一能力对于理解RNA的功能和其在细胞中的作用至关重要，尤其是在研究那些具有复杂结构和多功能性的长非编码RNA（lncRNA）和前体mRNA时。

针对U1 snRNA和NORAD lncRNA的研究，通过TREX技术成功鉴定了多个未知的与特定RNA区域结合的RBPs，为进一步研究这些RNA分子的功能和机制提供了新的线索。这些RBPs的鉴定有助于揭示RNA分子在细胞中的精确调控机制，包括剪接调控、基因表达调控等关键生物过程。

TREX在不同细胞类型中的应用潜力

TREX技术不仅在基础科学研究中具有广泛的应用前景，其在临床研究和疾病诊断中的应用潜力同样值得期待。通过在不同细胞类型中应用TREX技术，可以揭示特定疾病状态下RNA与蛋白质相互作用的变化，为疾病的早期诊断和治疗提供新的策略。

在肿瘤细胞中的应用可揭示与癌症进展相关的特定RNA与RBPs的相互作用，为发现新的癌症生物标志物和治疗靶点提供可能。在神经系统疾病模型中的应用，有助于理解神经退行性疾病中RNA与蛋白质相互作用的变化，为疾病的机制研究和药物开发提供重要信息。

TREX用于揭示在活细胞中结合特定RNA序列的蛋白质（Credit: Nature Methods）

TREX技术的实验设计与操作流程

样本准备与UV-C交联

在进行TREX技术的实验之前，首先需要准备好样本。样本的准备过程包括细胞的培养、收集以及使用UV-C光进行交联。UV-C交联是一个关键步骤，它通过UV光照射使得RNA分子与结合的蛋白质之间形成稳定的共价键，从而保持它们的相互作用状态不被后续的实验操作破坏。

细胞培养至适宜密度，以确保足够的样本量。使用冰冷的PBS洗涤细胞，移除培养基中的杂质。在冰上使用UV-C光照射细胞，光照强度和时间需要根据细胞类型和实验设计进行调整。

使用TREX技术进行RNA-蛋白质复合物的提取与鉴定

交联后的样本需要经过一系列的步骤来提取RNA-蛋白质复合物，并进行后续的鉴定。TREX技术的核心在于使用特异性的DNA探针和RNase H酶精确地剪切目标RNA，从而释放出与其结合的蛋白质。

将交联的样本用裂解液处理，释放细胞内的RNA-蛋白质复合物。添加特异性的DNA探针，这些探针能够与目标RNA特异性杂交。加入RNase H酶，特异性地剪切探针杂交的RNA区域，释放结合的蛋白质。通过质谱等技术对释放的蛋白质进行鉴定，确定与目标RNA相互作用的蛋白质。

数据分析与结果解释

通过TREX技术得到的数据需要进行详细的分析和解释，以确保实验结果的准确性和可靠性。数据分析主要包括蛋白质鉴定的结果分析、相互作用网络的构建以及功能注释。

使用专业的软件对质谱数据进行处理，识别出特定的蛋白质。根据蛋白质的鉴定结果，构建RNA与蛋白质之间的相互作用网络，分析这些相互作用在细胞中可能发挥的功能。结合生物信息学工具，对鉴定到的蛋白质进行功能注释，探索它们在生物学过程中的角色。

TREX技术面临的挑战与未来展望

技术限制与潜在的改进方向

尽管TREX技术为RNA与蛋白质相互作用的研究提供了一种强有力的工具，但其在应用过程中仍然面临一系列的技术挑战。首先，特异性DNA探针的设计与合成需要高度精确，以确保对目标RNA区域的特异性识别。此外，RNase H介导的RNA裂解过程需要严格的条件控制，以避免非特异性的RNA降解。针对这些技术难题，未来的研究可以探索更高效的探针设计算法，以及更为精细的酶反应条件优化，从而提升TREX技术的应用效率和数据准确性。

探针设计的优化：开发更高级的生物信息学工具，提高DNA探针的设计精度，减少非特异性结合。

酶反应条件的精细调控：通过实验参数的细致调整，优化RNase H的作用效率，减少背景噪音。

TREX在疾病机制研究中的应用前景

TREX技术在疾病机制研究中展现出巨大的应用潜力。通过精确鉴定疾病状态下的RNA-蛋白质相互作用变化，TREX技术不仅能够帮助研究人员深入理解疾病的分子机制，还能够为疾病的诊断和治疗提供新的靶点。例如，在肿瘤学研究中，通过分析肿瘤细胞特有的RNA-蛋白质相互作用，可能发现新的肿瘤生物标志物或治疗靶点。

疾病诊断：识别特定疾病状态下的独特RNA-蛋白质相互作用，开发新的诊断标志物。

靶向治疗：通过阻断异常的RNA-蛋白质相互作用，设计新型的靶向治疗策略。

结合TREX技术的创新应用

随着生物技术的不断进步，结合TREX技术的创新应用将不断涌现。例如，将TREX技术与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，可以实现对特定RNA-蛋白质相互作用的精确干预，进而探索其在细胞功能中的作用。此外，结合高通量测序技术，TREX技术可以用于全基因组范围内的RNA-蛋白质相互作用研究，极大地扩展了其研究范围和深度。

技术融合应用：探索TREX技术与其他前沿生物技术的结合应用，拓宽研究视野。

高通量分析：利用TREX技术进行大规模的RNA-蛋白质相互作用筛选，揭示细胞调控网络的全貌。