实现多种细胞的图案化共培养，浙大团队发展细胞排布新方法，为细胞的生物制造带来替代策略
来源：生辉 2023-08-18 10:41
近日，浙大团队提出一种面向细胞排布操作的新方案——磁阿基米德法，其具备快速、高效、低损伤的特点。
近日，浙大团队提出一种面向细胞排布操作的新方案——磁阿基米德法，其具备快速、高效、低损伤的特点。
就应用前景来说，磁阿基米德法在单种细胞的高通量 & 高精密度组装、多种细胞的层层复合组装、以及复合密闭结构内的外场操纵组装上，都能产生不错的效果。
此外，课题组还模拟了体内组织的形态结构，并在体外病理模型中复现了其他实验室的结果。
比如，在研究细胞的迁移时，他们使用磁阿基米德法来替代经典的划痕法。通过此，可以在水凝胶等脆弱的基底上构建出清晰的无细胞区域，并且不会破坏原有的基底。
通过使用磁阿基米德法，该团队还在在狭小密闭的微流道芯片内，实现了多种细胞的图案化共培养。
另据悉，其还在 96 孔板内一次性构建 96 个尺寸均匀的“划痕”。而传统划痕法由于受制于操作空间，一般需要使用孔径更大的孔板。
对于磁阿基米德法来说，它使用的细胞用量比传统方法更少，故能提高实验稳定性，并能减少大量重复性操作。
同时，它无需对细胞进行预标记，对于基底材料和操作装置没有特定要求，因此有望用于从二维到三维的细胞图案化，在体外细胞生物学研究和体内植入治疗的组织工程中具有广泛的应用前景。
▲图 | 基于磁阿基米德效应的细胞图案化应用。左：细胞迁移模型，有望替代细胞划痕实验；中：图案化后在同一芯片上研究四种状态下瓣膜细胞与免疫细胞相互作用；右：微流道芯片内的细胞图案化，用于研究细胞的动态药物响应（来源：ACS Nano）
浙江大学医学院附属第二医院任探琛研究员是共同一作兼共同通讯，浙江大学王建安教授和朱旸研究员担任共同通讯。
据介绍，细胞体外研究体系建立至今已有百年之久。当前，世界各地的生医实验室大多以单层细胞培养的方式进行体外研究。这种传统的细胞培养方式，很难模拟真实的生物组织。
在远程场中，磁场的传播几乎不受非磁性物质的干扰，故有望在不受生物环境和材料性质干扰的情况下，实现细胞组装和有序排布。
在磁性纳米粒子的帮助之下，对细胞或材料进行预标记，进而通过磁场吸引力来控制磁性纳米粒子的运动，是磁场调控细胞行为的经典方法。
然而，该方法需要使用磁性纳米粒子，这些粒子可能会残留在细胞内，从而产生潜在的细胞毒性，并且有可能干扰后续的细胞表征。
在磁场作用之下，除能利用铁磁性的磁性纳米粒子产生正向磁泳之外，也能利用细胞本身的抗磁性及其与介质磁化率的差异产生排斥力，借此推动细胞向磁场较低的方向运动，从而实现负向磁泳，借此调控细胞运动和空间分布。这一过程也被称作磁阿基米德效应。
在磁阿基米德效应的帮助之下，荷兰物理学家、诺贝尔物理学得主安德烈·海姆（Andre K.Geim）教授曾首次在强磁场中实现活青蛙的磁悬浮。
▲图 | 基于磁阿基米德效应的细胞图案化原理图。（A）细胞受力情况分析；（B）图案化装置范例；（C）图案化形成的细胞运动过程（来源：ACS Nano）
如上图所示，当把磁铁置于细胞底部时，磁场方向与重力方向相反；当磁力与浮力之和小于重力时，细胞下沉；当磁力与浮力之和大于等于重力时，则有望实现磁悬浮。
由于磁场 B 会随着细胞与磁铁的距离的三次方出现急剧衰减，理论上在磁场上方可以形成一个细胞清空区域。在该区域的边缘，细胞在 z 方向处于相对静止的状态。
细胞本身具备抗磁性，且其所在的培养基环境亦为弱抗磁性。当物体与周围介质磁化率的差异较小时，必须得有极大的磁场强度，才能产生足够的排斥力，从而实现细胞运动方式的改变。
在以往报道之中，人们通过磁场来直接悬浮非磁性物体，但这需要 10T 以上的强磁。
如此强的磁场仅能通过电磁场产生，因此需要专业的设备和电力线路，一般高校的生物学实验室通常很难配备。
除了改变磁场强度之外，还可以在细胞培养基中加入顺磁剂来增大 ∆χ，这样也能在相对较弱的磁场之下实现细胞的磁悬浮。
然而，目前来看利用磁阿基米德效应，以非接触的方式制造更为复杂的细胞图案仍然具有挑战性。关注到上述情况之后，浙大团队开展了本次研究。
研究中，在对相关文献进行调研之后，课题组针对一批具有不同形状的“迷你”磁铁组合的静磁场分布进行仿真建模。
结果显示，在各种不同形状的“迷你”磁铁的引导下，细胞们都可以汇聚组装成对应的图案。并且，细胞的后续生长不会受到影响。
此外，课题组发现：通过调节顺磁剂钆喷酸葡胺的添加浓度，可以实现图案大小的进一步调整。而且通过层层叠加的方式，还能实现多种细胞的组装。
利用这些操作，他们制作了更加复杂的细胞组合图案。最后，该团队探索了一些应用实例。比如高通量地制作形状大小均一细胞团块阵列、“一步法”地制作大批量的细胞划痕实验。
相比传统操作方法，本次方法不仅可以提高效率，而且由于磁场操控的非接触式特点，还能实现传统方法难以达到的效果。
比如，他们可以在脆弱的软质水凝胶表面、或者生物瓣的弹性光滑表面来研究细胞的迁移；还可以在密闭的微流道空间内操纵细胞的排列。
另外，利用多种细胞的组合组装与共培养，该团队模拟了体内的多细胞组织结构。
磁阿基米德法的两大特点是：高通量、以及对于细胞具备高利用率。因此，他们希望能选择来源较为有限的细胞来体现该方法的价值。
刚好课题组的另一个研究方向是心脏瓣膜钙化。由于瓣膜组织在体内的占比很小，故难以从小动物中分离细胞；而由于缺乏特异性高的标记物，故难以从干细胞分化得到。
此前，他们做实验时的细胞来源，一般是心脏移植的临床样本。而且，每次分离所得到的细胞数量极其有限，细胞的扩增能力也比较差。
为此，他们选择心脏瓣膜钙化时的炎症浸润，来作为体外研究应用的模型，借此构建一种图案化共培养的芯片，这款芯片主要基于心脏瓣膜内的皮细胞和心脏瓣膜基质细胞。
那么，在单种细胞或两种细胞共同存在的情况之下，心脏瓣膜钙化与免疫细胞浸润到底有着怎样的关系？关注到这一问题之后，课题组对其加以研究，并与临床样本进行比对。
研究中，他们还发现通过精确控制永磁铁阵列的组装和排列模式，可以在细胞培养系统之中，产生区域化的磁场分布，从而实现定域化的磁悬浮，进而让细胞呈图案化分布。
其中，永磁体不仅可作为磁悬浮力的来源，也可以作为细胞图形结构的模板。在细胞培养的容器底部，磁场呈现出周期性的分布，因此细胞会向 Fbuoy+Fmag-z <Fgrav 的区域聚集。
受到磁铁制备工艺的限制，永磁体的大小和形状的可调性比较差。对于坡莫合金来说，这让它可以大幅降低磁场随距离的衰减，从而在合金上刻制复杂的图案。
由于磁场的传播几乎不会受到非磁性物质的影响，因此有望针对材料性质和细胞分布实现独立调控。
比如，在不同性质的基底、在水凝胶表面和内部、在已成型的多孔材料内部、以及在微流道内部进行图案化的细胞组装。
▲图 | 磁阿基米德法构建复杂细胞图案（来源：ACS Nano）
整体来看，本次成果主要集中在二维平面上的细胞排布操作。目前，该团队正在把本次方法向三维空间的应用上推进。
任探琛表示：“正如审稿人所指出，从多细胞组装共培养、到病理模型的探索结果来看，我们的实践目前还是局限于体外实验范围。”
因此，他们希望在将本次技术用于三维空间的细胞排布的同时，也能结合组织工程技术在在体内应用中做探索。
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