Science ：Jennifer Doudna 团队揭秘细菌抗病毒免疫创新机制：核酸酶 - 蛋白酶对的反复获取与保守激活

细菌与古菌长期面临噬菌体的持续感染压力，驱动了 CRISPR-Cas、CBASS、Avs 等多样化抗病毒免疫系统的进化。这些系统常通过将新基因整合到现有通路实现功能革新，但新获取基因在不同防御系统中是否遵循统一作用机制、能否形成 “通用功能模块”，始终是领域内待解的核心科学问题。

近日，美国加州大学伯克利分校化学系、创新基因组学研究所Jennifer A. Doudna 团队（Owen T. Tuck 与 Jason J. Hu 为共同第一作者）在Science发表题为 Recurrent acquisition of nuclease-protease pairs in antiviral immunity 的研究论文。

该研究通过细胞实验、生化分析与系统发育追踪，明确三大核心发现：一是 Hachiman、AVAST、Lamassu、DRT 等 4 类进化独立的细菌抗病毒系统，均通过水平基因转移多次独立获取编码金属 β- 内酰胺酶（MBL）型核酸酶与胰蛋白酶样蛋白酶的基因对；二是这些基因对遵循 “蛋白酶切割解除核酸酶门控抑制” 的保守激活机制，且需依赖病毒感染信号调控以避免自身免疫损伤；三是鉴定出全新的 caspase - 核酸酶（canu）防御系统，其激活模式与真核凋亡通路存在进化相似性。

该研究为理解微生物免疫的模块化进化提供了关键实验证据。

研究团队首先通过序列同源性搜索（使用Clustal Omega、MAFFT 工具）与结构预测（基于 AlphaFold3）发现，Hachiman、AVAST、Lamassu、DRT 等 4 类功能迥异的细菌抗病毒系统中，均存在共现的两类基因：一是编码 MBL 型水解酶超家族蛋白的基因（预测为核酸酶），二是编码胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

其中核酸酶基因通常位于上游，蛋白酶基因则与各系统的核心防御酶（如 Hachiman 的 HamA、AVAST 的 Avs1a、Lamassu 的 LmuA）形成 N 端融合蛋白，这一基因排布在不同系统中高度保守。

系统发育分析（采用 IQ-TREE 2 构建进化树）进一步揭示，除少数 DRT 系统变异体外，这些系统均通过水平基因转移多次独立获取该核酸酶 - 蛋白酶基因对，且核酸酶与蛋白酶的进化树拓扑结构高度相似，表明二者存在紧密共进化关系，转移过程中始终以 “配对形式” 传递。

值得注意的是，该基因对还存在于未被注释的基因组 “防御岛”（含转座酶等免疫相关元件）中，暗示其潜在免疫功能；且约 5% 的 Hachiman 系统中，蛋白酶 - HamA 融合蛋白的 HamA 结构域失去经典 D-GEXK 催化基序，表明这些系统通过 “失活自身核酸酶功能、依赖新获取的 MBL 型核酸酶” 实现免疫重塑，进一步印证该基因对的功能核心地位。

图 1 核酸酶 - 蛋白酶功能模块的跨系统分布与进化特征

为阐明该模块的作用机制，团队以 Pseudomonas fluorescens 的 Hachiman 系统（PflHamMAB locus）为模型展开研究。纯化的 HamM（MBL 型核酸酶）单独孵育时无 DNA 降解活性，AlphaFold3 结构预测显示，其 MBL 结构域中存在两个无序插入片段，恰好覆盖核酸酶活性中心形成 “门控” 抑制状态 —— 这与天然转化相关 MBL 核酸酶（如 Bacillus subtilis ComEC）的结构存在显著差异。

将 HamM 与 HamAB 复合物（含蛋白酶 - HamA 融合蛋白、HamB 解旋酶）共孵育后，SDS-PAGE 检测到 42 kDa 的全长 HamM 消失，出现 3 个特异性水解片段；质谱分析（依托 QB3/Chemistry Mass Spectrometry Facility 平台）定位切割位点为插入片段中的异亮氨酸残基（I118、I218），且该切割具有高度特异性，HamAB 无法切割其他无关蛋白，突变异亮氨酸位点后切割完全消失。体外 DNA 降解实验显示，单独 HamM 或 HamAB 孵育质粒 DNA 时仅产生少量切口，二者共孵育时质粒 DNA 在 10 分钟内完全降解，且激活后的核酸酶可降解短双链 DNA、单链 DNA 及噬菌体 EdH4 的基因组 DNA，但不切割 RNA，证明其底物特异性为 DNA。

“预切割” 实验进一步证实，在 HamM 的异亮氨酸位点人工引入断裂后，即使无 HamAB 存在，该 “预切割 HamM” 也会对宿主 E. coli 产生显著毒性，直接证明插入片段的移除是核酸酶激活的关键。

该激活过程还需双重信号调控以避免误激活：噬菌体感染产生的 DNA 中间体可触发 HamB 解旋酶的 ATP 水解，而 ATP 存在时会抑制 HamM 切割，ATP 水解后抑制解除；若加入非水解性 ATP 类似物（AMP-PNP），即使有 DNA 存在，HamM 也无法被激活。

同时，删除 HamA 的 dHamA 结构域后蛋白酶无法激活核酸酶，而将 dHamA 替换为人类 c-Jun 的亮氨酸拉链二聚化结构域后，蛋白酶可自主激活核酸酶，证明 HamA 的寡聚化是蛋白酶活性的前提。综上，Hachiman 系统的激活通路为：噬菌体DNA→HamB解旋酶 ATP 水解→蛋白酶 - HamA寡聚化→切割HamM的插入片段→核酸酶激活→DNA 降解→细胞死亡 / 生长停滞→阻断噬菌体复制。

图 2 Hachiman 系统中核酸酶的激活机制与信号调控从 DNA 感知到核酸酶激活的完整通路，双重调控（DNA+ATP 水解）与蛋白酶切割共同实现核酸酶的精准激活

为验证该机制的普适性，团队研究了与 Hachiman 无进化同源性的 AVAST 系统（Erwinia piriflorinigrans 的 EpiAvs locus）—— 该系统通过直接识别噬菌体末端酶激活，与 Hachiman 的 DNA 感知模式完全不同。

实验显示，EpiAvs 系统的核酸酶（EpiAvs1a）同样含两个遮挡活性位点的插入片段及保守异亮氨酸切割位点（I134、I234）；突变这些位点后，EpiAvs 对噬菌体 P1 的防御能力显著下降，双突变则完全失去防御功能；Western blot 检测发现，噬菌体 P1 感染时 EpiAvs1a 被切割产生 18.9 kDa 的特异性片段，突变体无此片段。更关键的是，将 Citrobacter sp. ESBL3 的 AVAST 核酸酶替换 EpiAvs1a，构建的嵌合系统仍能有效抵御噬菌体 P1，证明该模块的功能可跨物种迁移，激活机制具有绝对保守性。

此外，Lamassu 系统的核酸酶同样含类似插入片段，且激活依赖核心蛋白寡聚化，进一步证实 “蛋白酶切割 + 寡聚化调控” 是多系统共享的激活范式。

系统发育分析中，团队还意外发现一类特殊的核酸酶同源物：其伴侣蛋白酶并非胰蛋白酶样，而是与真核 caspase 家族（调控凋亡的关键蛋白酶）高度同源，形成 “caspase - 核酸酶” 基因座（命名为 canu 系统）。

以 Klebsiella aerogenes 的 KaeCanABC 系统为模型研究发现，CanA（caspase 同源物）的结构与人类 MALT1 类胱天蛋白酶（调控 NF-κB 通路）的 C 端免疫球蛋白样（Ig 样）折叠高度同源（DALI Z-score=20.7），且 CanC（核酸酶）含保守的门控插入片段；表达 KaeCanABC 的 E. coli 可有效抵御噬菌体 T4，低感染复数（MOI=0.01）时可完全阻止裂解，高 MOI（10）时细胞才崩溃；突变 CanA 的 caspase 活性位点或 CanC 的切割位点均会丧失防御功能，体外实验显示 CanA 与 CanB 形成可溶性复合物，且 CanAB 浓度越高，CanC 的 DNA 降解活性越强。

通过筛选 T4 逃逸突变体，团队发现所有逃逸突变均位于 dda 基因（编码 SF1 家族解旋酶，参与噬菌体 DNA 复制），表明 Canu 系统通过感知噬菌体解旋酶激活防御。这一发现首次证实原核生物中存在“caspase - 核酸酶” 激活通路，与真核 caspase 介导的凋亡信号通路存在进化相似性，为理解免疫通路的跨域保守性提供了关键线索。

该研究通过多维度实验揭示了细菌抗病毒免疫的 “模块化进化” 规律，其科学价值体现在三方面：

理论层面，明确 “核酸酶 - 蛋白酶对” 是细菌免疫的 “通用功能模块”，通过水平基因转移实现跨系统功能拓展，修正了 “不同防御系统独立进化” 的传统认知；

机制层面，阐明 “门控抑制 + 蛋白酶激活 + 多信号调控” 的保守通路，为理解原核免疫的精准调控提供新范式，且首次建立核 caspase 与真核凋亡通路的进化关联；

应用层面，提供了基于 “共进化特征（核酸酶 - 蛋白酶共现）+ 结构特征（门控插入片段）” 的新型防御系统预测方法，为挖掘CRISPR 之外的抗病毒工具奠定基础 —— 例如该模块的可控激活特性，或可用于优化基因编辑工具的脱靶效应。

目前，研究团队已将相关质粒（Addgene ID: 248931-248960）与噬菌体测序数据（NCBI SRA: PRJNA1353595）公开，补充材料可通过https://science.sciencemag.org/cgi/content/full/science.aea8769/DC1获取。

未来，对 Canu 系统多样性的深入探索、以及该模块在古菌中的分布研究，或将进一步揭示免疫通路的起源与进化规律。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.aea8769