张进团队开发第二代iPS来源的CAR-巨噬细胞，在细胞治疗实体瘤领域取得系列突破

肿瘤的有效治一直是困扰医学界的重大难题之一。自CAR疗法概念于1989年的首次提出，到如今CAR-T细胞疗法在血液肿瘤临床治疗中展现出良好效果和前景，肿瘤的免疫细胞治疗研究一直占据肿瘤治疗领域最具瞩目的位置，并被寄予了攻克实体肿瘤的巨大期望。在CAR-T疗法成功应用于血液肿瘤治疗中且相关产品接连批准上市的同时，针对实体肿瘤的免疫细胞疗法也在呼唤更加“治之有效”的治疗产品。

作为先天性免疫第一道防线的巨噬细胞因其对异常细胞和病原微生物等抗原的免疫清除功能，以及调节免疫反应、浸润并长期驻留实体肿瘤组织等方面的功能特征，正日益凸显其在实体肿瘤治疗中的独特优势，吸引并激发了国内外学者的广泛关注和方兴未艾的研究热情。同时，在基因编辑技术手段日趋成熟和多样化的今天，巨噬细胞本身具备的功能多样性和可塑性正在使其成为越来越热门的抗实体肿瘤细胞药物研发的对象。其临床转化价值也非常可观。

近来，浙江大学基础医学院/良渚实验室/浙江大学医学院第一附属医院张进团队在针对实体肿瘤治疗的iPSC来源的CAR-Macrophage（CAR-M）研究工作上取得了一系列重要成果。

2023年11月27日，张进团队在 Nature Immunology 期刊发表了题为：A second generation M1-polarized CAR macrophage with antitumor efficacy 的研究成果【1】。

该项工作设计了抗原依赖性极化的第二代iPSC来源的CAR-Macrophage（CAR-iMAC），并阐明了其抗原依赖性极化和激活，以及通过“胞葬”作用杀伤肿瘤的机制， 为CAR-iMAC应用于实体肿瘤的免疫细胞治疗提供了更加坚实的理论基础。

CAR-T的迭代升级极大地增强了其在血液肿瘤治疗中的功效，也助推了相关细胞类药品的不断批准上市。作为免疫细胞治疗研究领域最新的Macrophage虽然自带诸多先天优势的光环，且借助T细胞特异性的CD3ζ-CAR（T-CAR）而构建的第一代CAR-Macrophage在实体肿瘤的治疗中也实现了其靶向性，但在实际治疗中依然有可能力不从心。究其原因主要在于：

1、第一代CAR-Macrophage在肿瘤免疫抑制性的微环境中极易被“诱骗”，从而转变为抑炎促癌的M2极化状态；

2、肿瘤微环境中大量的免疫抑制性的细胞依然难以被唤醒继而协同CAR-Macrophage一起杀伤肿瘤细胞。

因此，推陈出新，设计一款具有持续可控M1极化的CAR-Macrophage就成为其能否走向临床治疗的关键。为此，基于一系列的筛选，研究团队将目光锁定在了具有极化和激活巨噬细胞功能的Toll 样受体4（TLR4）上，并将其胞内TIR信号转导结构域通过基因工程手段“移花接木”到可识别特定抗原的CAR的胞内位置，继而构建了Macrophage专属的CAR（TIR-CAR/M-CAR）。

随后，借助团队成熟的iPSC分化CAR-iMAC平台和基因编辑技术得到了TIR-CAR-iMAC。接下来的功能验证实验证实基于TIR的CAR-iMAC实现了对巨噬细胞的抗原依赖性激活和M1极化。在杀伤肿瘤细胞的同时，相较于基于CD3ζ的CAR-iMAC，其也能分泌更高水平的促炎因子，并随时间的推进保持可观的M1极化水平。受到CAR-T迭代的启发，研究者随后通过串联CD3ζ和TIR信号结构域构建了第二代macrophage专属的CAR，寄希望于两者信号的正交互补能更好地激活第二代CAR-iMAC。

事实证明，第二代CAR-iMAC相对于第一代CAR-iMAC和TIR-CAR-iMAC，在极大地提升了靶向抗肿瘤功效的同时，也分泌了更高水平的IL6、IL12、IL23、TNF等促进抗肿瘤功效的免疫因子，并展现出了更强的类似树突状细胞的抗原呈递功能和抵御肿瘤免疫抑制性微环境“裹挟”的能力，继而维持了更高（CD80阳性率>80%）、更长时间（超过7天）的M1极化水平。单细胞测序也支持了这一结果，并证实与靶细胞共培养后的第二代CAR-iMAC显示出更接近于M1巨噬细胞的表达谱和类似树突状细胞细胞的表达谱。

图1. 第一代和第二代的T细胞CAR与巨噬细胞CAR

接下来在胶质母细胞瘤（GBM）小鼠颅内原位肿瘤模型和肝癌小鼠模型中的抗肿瘤实验进一步展示了第二代CAR-iMAC出色的治疗效果。在达到一定水平的效靶比的治疗剂量下，8只肝癌荷瘤小鼠中的6只得到了几乎完全的缓解，且所有实验小鼠均没有表现出不良反应。这一结果也预示第二代CAR-iMAC在治疗过程中安全可控。

值得注意的是，相对于第一代CAR-iMAC，第二代CAR-iMAC在体内抗肿瘤一段时间后依然维持了较理想的M1极化水平（CD80阳性率≈60%，CD163阳性率≈30%）。这一结果提示第二代CAR-iMAC在维持自身持续性抗肿瘤功效的同时，也能调动机体内各类先天性免疫细胞向实体肿瘤内部浸润，继而使实体肿瘤由“冷肿瘤”向“热肿瘤”转变。

为了进一步证实这一点，研究团队设计了第二代小鼠CAR-巨噬细胞（G2-CAR-BMDM）在具有完整免疫系统的Syngeneic小鼠肝癌模型中的抗肿瘤实验。结果显示，在CAR的表达率并不算高的情况下，G2-CAR-BMDM也能在发挥抗肿瘤功效的同时充分调动并激活小鼠体内的T细胞和NK细胞，继而将“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”。值得注意的是，和CD47抗体联用的策略进一步增强了第二代CAR-iMAC清除荷瘤小鼠的肿瘤负担。这一结果提示，与巨噬细胞免疫检查点抗体药物的联用将是未来CAR-iMAC应用于临床治疗的重要选择。

 图2. 第二代CAR-iMAC显著性地缓解了神经胶质瘤原位荷瘤小鼠的肿瘤负担

图3. 第二代CAR-iMAC展现出对肝癌的良好治疗效果

图4. 和CD47抗体联用有效的增强了CAR-iMAC对肿瘤的清除能力

接下来的机制探究实验证实NF-κb/P65的核聚集介导了基于TIR的CAR-iMAC在识别靶细胞后的M1极化和激活。阻止NF-κb/P65的入核显著性地抑制了基于TIR的CAR-iMAC的靶向杀伤功能。这一工作也证明了引入TIR而构建的巨噬细胞专属CAR的合理性和可行性。

新的问题接踵而来。研究团队在研究过程中发现，有别于Macrophage对抗血液肿瘤细胞时直接吞噬整个细胞的杀伤途径，CAR-iMAC在面对“异常狡猾”且胞体与自身旗鼓相当的实体肿瘤细胞时，传统的吞噬作用就显得力不从心。那么，第二代CAR-iMAC是如何杀伤实体肿瘤细胞的呢？

肿瘤坏死因子TNF在第二代CAR-iMAC识别靶细胞后的高表达现象给予了研究人员提示——第二代CAR-iMAC是否通过TNF促进肿瘤细胞的凋亡！凋亡检测实验和超高分辨实时成像证实了这一设想：一方面，和第二代CAR-iMAC共培养的靶细胞被检测到显著性的凋亡增多现象；另一方面，超高分辨实时成像也直观地看到了靶细胞被第二代CAR-iMAC锚定后逐渐发生凋亡或焦亡的现象，随后肿瘤细胞的凋亡小体被第二代CAR-iMAC吞噬清除。至此，该项工作揭示了第二代CAR-iMAC对抗实体肿瘤的作用机制，即通过诱导肿瘤细胞凋亡，而后清除凋亡小体的“胞葬”（efferocytosis）途径。

图5. 第二代CAR-iMAC通过“胞葬”作用清除肿瘤细胞

张进团队一直致力于iPSC来源的CAR-iMAC抗实体肿瘤的研究工作，并深耕积累，构建了一条系统性的研发路径。  

2020年11月，张进团队在 Journal of Hematology & Oncology 期刊发表了题为：Pluripotent stem cell-derived CAR-macrophage cells with antigen-dependent anti-cancer cell functions 的研究论文【2】。

2023年9月，张进团队与浙江大学转化医学研究院/医学院附属第二医院王本课题组合作，在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为：Targeted glycan degradation potentiates cellular immunotherapy for solid tumors 的研究论文【3】。

同月，张进团队在 Nature communications 期刊发表了题为：Metabolic Reprogramming via ACOD1 depletion enhances function of human induced pluripotent stem cell-derived CAR-macrophages in solid tumors 的研究性论文【4】。

图6. iPSC来源的CAR-iMAC研究轨迹

这项第二代CAR-iMAC研究论文的第一作者为浙江大学雷安华、余华，浙江大学张进为论文通讯作者。该研究受到了浙江大学陈家明教授、高志华教授、刘冲教授、刘志红院士、黄河教授，上海交通大学杨选明教授，哈佛大学George Church以及加州大学圣地亚哥分校Dan Kaufman与Huang Zhu的大力支持。