同济大学刘琦团队开发新型AI模型，用于CRISPR靶向预测和优化

近日，同济大学生命科学与技术学院生物信息学系、同济大学-上海自主智能无人系统科学中心刘琦教授课题组，联合之江实验室、罗氏上海创新中心和中国农业科学院等团队，在 Nature Communications 期刊发表了题为：Genome-wide CRISPR off-target prediction and optimization using RNA-DNA interaction fingerprints 的研究论文。

该研究发布了领域内首个基于分子互作指纹的CRISPR靶向效应预测和sgRNA优化模型——CRISOT（CRISPR Off-Target）。

针对CRISPR脱靶预测中面临的瓶颈，融合分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟和人工智能（artificial intelligence，AI）技术，利用MD模拟分析和构建CRISPR的RNA-DNA分子互作指纹，结合AI算法开发CRISPR脱靶预测模型，并提出有效的向导RNA（sgRNA）优化方法。GUIDE-seq和WGS实验均证明，CRISOT在全基因组脱靶效应预测和sgRNA优化上的高准确率和泛化性能。

该研究开发的CRISOT工具包包含四个模块（图1），即CRISOT-FP、CRISOT-Score、CRISOT-Spec和CRISORT-Opti，分别用于分子互作指纹生成、全基因组CRISPR脱靶预测、sgRNA靶向特异性评估和Cas9系统的sgRNA优化。依托之江智能计算基因平台，CRISOT网站目前已发布于https://crisot.aigene.org.cn/，方便研究人员使用。

图1. 结合分子机制的Cas9靶向效应预测的计算框架

CRISPR-Cas9介导的DNA剪切的分子机制，是由Cas9-sgRNA-DNA复合体内部的一系列互作驱动的，这些分子互作也决定了其脱靶效应的产生。本研究以Cas9-sgRNA-DNA复合体的核心——sgRNA-DNA为基础（图1a），设计并开展MD模拟表征CRISPR系统的RNA-DNA分子互作特征，包括氢键、结合自由能、原子位置和碱基对的几何特征等（图1b），这些特征构成了sgRNA-DNA的分子互作指纹，即CRISOT的第一个也是首要的模块——CRISOT-FP（图1c）。CRISOT-FP可以作为一种分子指纹（表征），以一种灵活的方式与不同的AI模型结合，用于预测CRISPR脱靶效应，本研究开发的模型表现出优秀的脱靶效应预测能力。

在此基础上，该研究将关键互作特征用于开发一个全新的、高效的脱靶效应打分方法，即CRISOT-Score（图1d），用于计算给定脱靶序列的脱靶打分。基于CRISOT-Score，通过叠加sgRNA在全基因组范围内所有CRISOT-Score打分高的脱靶位点，得到衡量该sgRNA靶向特异性的打分，即CRISOT-Spec（图1e）。

最后，该研究基于CRISOT-Score和CRISOT-Spec，开发了一种创新性的优化sgRNA的方法，即CRISOT-Opti（图1f）。面向靶向特异性不尽如人意的sgRNA，CRISOT-Opti通过引入单碱基突变获得突变体sgRNA并从中识别能维持一定打靶活性同时靶向特异性大大提升的突变体sgRNA。

该研究通过全面的计算和实验测试表明，CRISOT相较于现有工具的脱靶预测性能获得了很大的提升，且在准确预测BE（base editor）和PE（prime editor）的脱靶效应方面显示出潜力，表明RNA-DNA分子互作指纹捕获了不同CRISPR系统之间RNA-DNA相互作用的潜在机制。该研究所采用的引入分子动力学（MD）的方法，本质上是一种结合物理先验的AI方法，可以克服全基因组范围内脱靶预测模型对于大量训练样本的依赖，体现出一种考虑物理先验的小样本和可解释性的AI思想。

基因编辑作为一种疾病干预手段，已逐渐进入临床阶段，2023年11月16日，全球首个基于CRISPR-Cas9的基因编辑疗法CasgevyTM在英国获得有条件的上市许可，用于治疗镰刀状细胞贫血病（SCD）和输血依赖β-地中海贫血（TDT），然而，其潜在脱靶问题及由此带来的健康风险仍将持续受到关注。该研究通过全基因组测序实验表明，CRISOT成功优化了靶向原发性高胆固醇血症关键基因PCSK9和镰刀状细胞贫血病关键基因BCL11A的sgRNA，提高了其靶向特异性，表明了CRISOT是全基因组CRISPR脱靶预测、评估和sgRNA优化的一个有效和可推广的系统，可降低CRISPR基因组编辑中的脱靶风险。

可以预见，CRISOT将有助于sgRNA设计和优化，推动基因编辑进入临床级别的应用。

该论文通讯作者是同济大学刘琦教授、原罗氏上海创新中心张清博士和中国农业科学院左二伟研究员，共同第一作者为之江实验室陈钦畅、同济大学啜国晖和中国农业科学院张海航。该工作目前依托罗氏和同济大学，已申请国际PCT专利一项，后续正在开展进一步的临床转化研究。

刘琦教授课题组（https://bm2.tongji.edu.cn）致力于组学人工智能赋能的精准医学研究，在基因编辑系统的AI优化设计和新型基因编辑系统识别领域开发了一系列AI计算平台。于2018年发布了领域内首个基于预训练大模型的基因编辑优化设计平台DeepCRISPR（Genome Biology 2018）；于2020年发布了领域内首个脱靶预测基准评估的计算平台iGWOS（Nucleic Acids Research 2020）; 于2022年提出了结合MD和AI进行基因编辑系统优化和识别的观点论文（Science Bulletins 2022）。本次工作是在上述研究基础上的进一步突破。