Nat Methods : 自主生物发光成像技术在真核生物中的创新进展

在现代生物医学研究领域，生物发光成像技术凭借其非侵入性、无需外加光源以及高灵敏度的独特优势，已经成为研究生物体内各种生理和病理过程的重要工具。特别是随着1月22日一项研究成果（An improved pathway for autonomous bioluminescence imaging in eukaryotes）在Nat Methods （IF 48）杂志上的发表，科学家们通过对霓虹灯菌(Neonothopanus nambi)中的生物发光途径进行改良，成功实现了在植物、真菌和哺乳动物宿主中自主发光亮度的显著提升，这一成就无疑为生物发光成像技术的进一步发展和广泛应用提供了强有力的支持。

 

自然界的生物发光现象一直是科学家们研究的热门话题。霓虹灯菌的发现为在非自发光的真核生物中引入自主发光的可能性提供了新的思路。然而，将这一现象应用于异源宿主时，由于原生真菌酶的性能限制，其发光亮度往往难以满足实验要求，这成为推广其应用的一大障碍。

 

在这项研究中，科学家们成功优化了真核生物中的自主生物发光途径，显著提高了在植物、真菌和哺乳动物宿主中的生物发光亮度。通过对Neonothopanus nambi真菌中的生物发光途径组分进行定向进化和改造，研究团队开发出了两种优化的生物发光途径版本：FBP2和FBP3，它们在多种宿主中实现了比原始途径（FBP1）高出一个到两个数量级的发光亮度。

研究中涉及对两个关键酶nnLuz（荧光素酶）和nnH3H（hispidin-3-羟化酶）的改造。对nnLuz的定向进化产生了含有三个氨基酸替换（T99P, T192S和A199P）的nnLuz_v3变体，这些替换增加了其在细菌和哺乳动物细胞中的稳定性和亮度。进一步的随机突变产生了nnLuz_v4，它包含了额外的四个氨基酸替换（I3S, N4T, F11L和I63T），在酵母中显示出改善的热稳定性和催化活性。

nnH3H的定向进化确定了五个增强亮度的氨基酸替换（D37E, V181I, A183P, S323M和M385K）。通过组合这些突变，得到了进一步增强亮度的nnH3H_v2。

此外，研究还发现，来自Mycena citricolor的hispidin合成酶mcitHispS在多种异源宿主中的表现优于nnHispS，尤其是在植物中。通过将改造后的酶组合在一起，形成了FBP2（包含nnHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH和NpgA）和FBP3（包含mcitHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH和NpgA）两种优化途径。

在实验中，FBP2和FBP3在植物、酵母和哺乳动物细胞培养系统中表现出了明显的亮度优势。特别是在植物中，FBP2和FBP3不仅提高了发光亮度，而且在六个代表四个双子叶植物科的物种中实现了稳定的转基因表达，这些物种包括模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana benthamiana），以及快速生长的树种加拿大杨（Populus canadensis）、观赏植物矮牵牛（Petunia hybrida）和菊花（Chrysanthemum morifolium）。

研究结果表明，FBP2和FBP3具有在植物中实现视频速率生物发光成像的潜力，即使在微弱的外部光照条件下也能使用消费级相机可靠地监测植物的生物发光。最明亮的组织——矮牵牛的花蕾甚至可以使用现代智能手机相机进行记录。

转基因植株稳定表达生物发光途径不同版本的发光性：3周龄尼古丁树叶的平均亮度（Credit: Nat Methods）