茶叶也能“寻根”：Fluidigm微流控技术助力乌龙茶种质鉴定

近日，福建农林大学联合福建省出入境检验检疫局的研究小组在Tree Genetics & Genomes发表最新论文《Genetic diversity of oolong tea (Camellia sinensis) germplasms based on the nanofluidic array of single-nucleotide polymorphism (SNP) markers》。该研究首次利用EST-SNP引物结合纳升级微流控芯片的SNP分子标记技术展示了100种乌龙茶的遗传多样性，并开发了一套完整、可靠的中国乌龙茶种质鉴定工具。

乌龙茶亦称青茶、半发酵茶及全发酵茶，品种较多，是中国几大茶类中，独具鲜明中国特色的茶叶品类。丰富的乌龙茶种质资源是乌龙茶产品品质和口感的基础条件。大量的乌龙茶是依据地方品种或者栽培品种来命名的，例如“铁观音”“肉桂”“水仙”“宋种”“金萱茶”等，因此种质鉴定与茶的品质息息相关。由于历史的局限性，种质资源的档案并不完善，面对庞大而复杂的地方和栽培品种，想鉴定茶叶的来源困难重重。并且，尽管乌龙茶种质资源丰富，只有少数品种被广泛种植，大量的品种没有被推广开来，处于沉寂状态。因此，对乌龙茶种质资源遗传背景的研究，不但有利于确定产品来源，为茶叶的品控及市场定价提供参考。更有利于茶树种质资源的保护，为今后的育种工作奠定基础。

乌龙茶主要产于福建的闽北、闽南、广东及台湾，合称乌龙茶四大产区。四川、湖南等省也有少量生产。研究小组利用高通量SNP分型技术对100份来自福建、广东和台湾的茶树样本的遗传多样性和亲缘关系进行了分析。由于这些茶树样本的产地相对集中，这就需要具有高度分型能力的SNP分型引物。研究小组前期已从茶树的表达序列标签（EST）数据库中评估出96对候选引物。可是，该如何快速、准确地筛选验证这些引物呢？研究小组采用了Fluidigm EP1/Juno高通量微流控PCR系统。该系统能够在3小时内完成9216个PCR反应，在一次反应中同时完成96个样本96个SNP的检测。经过筛选，75个SNP位点能够用于乌龙茶种质的分型及亲缘关系的鉴定。

通过对SNP各位点信息的追踪，可以构建出四个主要乌龙茶产区的DNA指纹图谱并且揭示出他们之间的遗传关系。100份乌龙茶样本可以分成两大类群。广东乌龙茶种质资源是一个比较独特的类群，台湾乌龙茶种质资源的基因型与福建群体相近，与闽南、闽北共同形成另一个类群。闽南和闽北栽培品种的茶树种质资源在基因型上有很多交集，但也表现出各自的特点。

上图：系统树图展示了100个中国乌龙茶种质的遗传关系

中国西南地区是茶树的发源地，当传播到中国其他地方和世界各地后发生了遗传分化。根据茶史记载，福建的茶树资源引自浙江省北部和江苏省。而广州的茶树资源起源于与云南省之间的水陆运输交流。这与本文的研究成果遥相呼应，表明地理学差异造就了广州和福建乌龙茶种质巨大的遗传差异。台湾的种质资源被聚类到福建群体中，验证了台湾的茶树资源来自于福建的说法。

这一项研究结果为茶树种质资源亲本的鉴定、整合和选择提供了指导。对茶叶品种的鉴定、茶叶的育种以及茶叶生产的质控等诸多领域产生深远的影响。利用Fluidigm公司的微流控技术，有助于研究者建立快速高通量的茶叶品种鉴定方法，在获得高质量数据的同时，也大大缩短了实验周期，并降低了实验成本。

茶树富含多酚和多糖类物质，这些物质残留在茶树DNA中往往影响分型效果。Fluidigm Juno 96.96芯片开创性地采用芯片上预扩增后自动进行SNP分型检测的策略，结合先进的微流控技术，可以有效地去除多酚、多糖等抑制剂对基因分型结果的影响。无论是叶片的还是种胚来源的，无论是新鲜的、干的还是发酵的样本，Juno 96.96芯片都能够一网打尽，得到精确的分型结果。

茶叶都有“身份证”了，您手里的乌龙茶是到底是哪个品系的，您清楚了吗？

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Fluidigm公司的Juno系统是基于公司创新的微流控技术，这一技术使科学家能够利用不同类型的样品开展SNP基因分型实验。这一系统包括一套平台（Juno搭载EP1或者Biomark系统），微流控芯片和一套混合液。研究人员可以在不到3小时的时间内处理低浓度DNA样本（比如组织、口腔拭子、血、石蜡包埋组织）或者质量低的困难DNA样本并完成SNP基因分型。 

除了这些优势外，该系统还可以完成多种检测，例如基因表达、CNV、数字PCR以及样本鉴定等。

此外，Juno可制备测序文库。Juno的LP芯片可同时针对192个样本，每个样本多达2400个目标序列进行扩增和建库，大大提高了建库的效率、准确率，降低了制备成本。最近Juno又具有了制备RNA-seq文库的新功能！

参考文献：

[1]  Lin Y1, Yu WT2, Zhou L3, et al. Genetic diversity of oolong tea (Camellia sinensis) germplasms based on the nanofluidic array of single-nucleotide polymorphism (SNP) markers. Tree Genetics & Genomes (2020) 1614-2950

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