颜宁团队利用单粒子冷冻显微镜成功揭示嵌入到脂质体中的膜蛋白的精细化结构！

2020年7月29日 讯 /生物谷BIOON/ --离子通道蛋白和膜转运蛋白的作用是在细胞膜上移动离子和小分子，其对于细胞代谢和稳态的维持非常必要，同时还能作为机体多种生物性的信号通路，研究人员认为，这两类蛋白对于机体健康极其重要，这些蛋白的缺陷往往与多种疾病发生直接相关；为了理解特殊蛋白的缺陷为何会引发疾病，我们不仅要知道这种蛋白的作用，而且还要知道其是如何发挥作用的，深入研究蛋白质的结构就能让科学家们更好地掌握其作用机制，由于当前技术无法对离子通道蛋白和膜转运蛋白进行高分辨率成像，以至于科学家们并不清楚这两种蛋白的具体结构。

近年来，在低温电子显微镜（cryo-EM，cryogenic electron microscopy）技术的帮助下，科学家们就开始慢慢解决多种膜蛋白的成像问题了；近日，一篇发表在PNAS杂志上题为“Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome”的研究报告中，来自普林斯顿大学颜宁课题组的研究人员通过研究就利用cryo-EM技术对嵌入到脂质体中的膜蛋白进行了详细分析。

图片来源：Xia Yao，et al.PNAS， July 17， 2020 doi：10.1073/pnas.2009385117

当X射线晶体学技术作为主流研究手段时，膜蛋白往往是结构生物学研究领域最难研究的靶点，随着单粒子冷冻电镜技术的突破性进展，如今研究者在阐明离体膜蛋白的清晰结构上也取得了一定进展，下一个挑战将是如何保持电化学梯度和膜曲率，从而全面阐明膜蛋白的结构，其生物学功能依赖于这些化学和物理特性。这项研究中，研究人员利用特征明确的原型蛋白AcrB作为基础提出了一种方便的工作流程，从而用于对嵌入到脂质体中的膜蛋白进行冷冻电镜（cryo-EM）结构分析。将优化的蛋白脂质体分离技术、在石墨烯网格上进行低温样本的制备以及有效的颗粒筛选策略进行结合后，研究人员就能在3.9埃分辨率下获得嵌入到脂质体中的AcrB蛋白的三维（3D）重建结构，当周围的膜显示不同的曲率时，同源性的AcrB的构象依然会保持不变，这种广泛被用于不同可溶性结构域膜蛋白的cryo-EM结构分析方法或许就为对整体或外部膜蛋白的cryo-EM分析奠定了一定的基础，这些膜蛋白会受到跨膜电化学梯度或膜曲率的影响。

研究者表示，我们通过将优化的蛋白脂质体制备步骤、高质量的石墨烯网格及深度2D分类技术相结合，提出了一种用于对嵌入到脂质体中的膜蛋白进行高分辨率cryo-EM分析的完整工作流程。基于排阻色谱法（SEC，size-exclusion chromatography）的制备方法就能够选择性地控制蛋白脂质体的尺寸，而石墨烯网格则能显著改善蛋白脂质体在视野中的密度和分布情况，同时其还支持基于低倍分辨率图像模式的合理化数据收集策略，而深度2D分类程序则能够方便地选择嵌入脂质体的膜蛋白颗粒进行常规的单粒子分析，从而就避免了复杂和较高要求的预处理。

值得注意的是，来自嵌入AcrB的可溶性结构域的信号能促进对深入2D分类中的粒子选择，如果没有这种具有明显轮廓/外形的可溶性结构域，从膜上选择跨膜结构域似乎是不太切合实际的，因此，研究者所开发的方法主要适用于具有明显轮廓且尺寸合理的膜蛋白；从另一方面来讲，一种初始的模型能作为一种模板来促进对颗粒的筛选，如果一种膜蛋白能被成功地重构到脂质体中，那么通过常规的单粒子cryo-EM分析，研究者至少就能在去污剂微团或纳米盘中获得较低分辨率的3D重建图像，因此，这个先决条件并不代表这种方法应用的障碍。

有意思的是，研究者还发现，在所有AcrB侧面视图中有98%的颗粒在其脂质体中都拥有可溶性的结构域，定位分析也能够扩展到纠正脂质体功能测试中对运输效率的计算，其通常有50/50的分布假设，而这可能是由脂质或去污剂的组成物所引起的，但对脂质体优先定位的进一步理解还需要科学家们后期更为深入的研究。研究者的设想是他们所开发的新方法能应用到一系列的结构-功能相关的研究中去，而目的之一就是调查离子或其它底物的跨膜梯度对靶蛋白功能和结构的影响，比如电压门控离子通道蛋白和质子驱动的转运蛋白等。

目前研究人员所面临的最大的技术障碍就是制备具有可控跨膜梯度的蛋白脂质体低温样品，因为脂质体的泄露是一个非常严重的问题，特别是在骤降冷冻过程中；最后研究者表示，尽管如此，我们所开发的新方法/工作流能够快速分析膜曲率，对膜成形、融合和裂变产生反应的特殊蛋白质以及诸如Piezo等机械敏感通道之间相互依赖性，机械敏感通道依赖于膜曲率，同时本文研究结果也为后期科学家们将cryo-EM技术广泛用于分析膜蛋白和膜结构奠定了一定的基础。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

【1】Researcher tackles long-standing mysteries about membrane protein structure

【2】Xia Yao，Xiao Fan， Nieng Yan， et al. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome， PNAS， July 17， 2020 doi：10.1073/pnas.2009385117