研究揭示人源TRPC5通道被不同小分子所抑制的结构基础

TRPC5是受体激活的非选择性阳离子通道，属于瞬时受体电位通道（TRP）家族中的经典型亚家族（TRPC）1。TRPC5通道的激活将引起细胞膜去极化和胞质内钙浓度上升。TRPC5通道主要表达于脑组织，在肝脏、肾脏等器官中也有一定程度的分布2-4。TRPC5介导多种生理过程，与恐惧、焦虑、抑郁等情绪的产生以及进行性肾脏疾病有关5，6。近期研究表明TRPC5通道是治疗焦虑、抑郁和肾病的潜在药物靶点7-9。目前，由Hydra公司和Boehringer Ingelheim合作开发的一种TRPC4/5抑制剂正在临床试验中，用于治疗焦虑和抑郁10；由Goldfinch Bio开发的TRPC5抑制剂GFB-887（NCT number： NCT03970122）正处于治疗肾病的临床I期试验中。尽管TRPC5抑制剂的开发如火如荼，TRPC5抑制剂是如何结合TRPC5通道并发挥抑制作用的仍不清楚。

北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大-清华生命科学联合中心陈雷研究组在eLife杂志上报道了人源TRPC5通道分别与两种小分子抑制剂结合的高分辨结构。

作者们纯化了C端截短的人源TRPC5（hTRPC51-764），该截短体具有比全长TRPC5更高的四聚体表达量，并且像全长TRPC5一样，仍然能被激活剂（-）-englerin A（简称EA）和高浓度胞外钙激活，也能被抑制剂clemizole（简称CMZ）和HC-070抑制。CMZ是苯并咪唑衍生物，HC-070是甲基黄嘌呤衍生物，对TRPC4、TRPC5具有很高的抑制效力。这两类抑制剂具有截然不同的大小、形状和化学特性，因而可能结合在TRPC5上的不同位置。作者们向纯化后的hTRPC51-764蛋白样品中分别添加CMZ和HC-070，制备了冷冻电镜样品，通过单颗粒冷冻电镜技术获得了2.7？高分辨率的hTRPC51-764与CMZ结合的电子密度和hTRPC51-764与HC-070结合的电子密度并搭建了原子模型。

结构显示抑制剂结合的TRPC5具有四重对称性（图1），整个通道由跨膜区和胞质区组成，并且通道处于关闭状态。

CMZ结合在跨膜区的由跨膜螺旋S1-S4组成的电压传感器样结构域（VSLD）（图2）。与CMZ距离近的氨基酸中，F414与CMZ的氯苯环形成π-π堆积作用；Y374，M442，Y446和P659与CMZ形成疏水相互作用（图2）。功能实验结果显示，将N443突变成TRPC3/6上对应的氨基酸亮氨酸后，CMZ的抑制效力明显减弱（图2），说明N443对于CMZ发挥抑制作用很重要，也解释了CMZ对于TRPC不同亚型的选择作用。

HC-070结合在跨膜区的孔道结构域，结合位点由一个亚基的跨膜螺旋S5、孔道螺旋和相邻亚基的跨膜螺旋S6组成 （图3）。HC-070与TRPC5上的众多氨基酸有相互作用：F576的侧链与HC-070的甲基黄嘌呤形成π-π堆积作用；R557，Q573，W577与HC-070的羟丙基形成极性相互作用；F599，A602和T603同时也参与稳定羟丙基；F569和L572与HC-070的氯苯环形成疏水相互作用（图3）。功能实验结果显示，HC-070对以下这些突变体：R557A， F569A， L572A， Q573A，F599A，F599N，T603A的抑制效力减弱，其中，对Q573A的抑制效力减弱得最明显（图3），说明Q573A与HC-070羟丙基形成的氢键对于HC-070结合并抑制TRPC5具有至关重要的作用。

在电子密度图中，作者还观察到了结合的离子和脂类。其中一个可能的离子结合位点位于跨膜区的VSLD，由E418，E421，N436和D439组成（图4）。在鼠源TRPC4和鼠源TRPC5中也曾观察到相似密度11，12；在TRPM2，TRPM4和TRPM8中观察到的相似密度被鉴定为钙离子13-15。作者们发现E418Q-E421Q-D439N三突变体失去了对胞外钙的响应，说明该位点对于钙激活有着至关重要的作用。观察到的另一个可能的离子结合位点位于胞质区，由H172，C176，C178，C181组成，类似于细菌中葡糖激酶的HC3型锌结合位点16。C176A-C178A-C181A三突变体对EA和钙的响应不变，说明该位点可能参与离子通道门控以外的其他调控作用。

在跨膜区有数个脂类/去垢剂结合位点 （图4）。在结合CMZ的TRPC5电子密度图中，在跨膜螺旋S5和S6之间观察到了类似DAG的密度。HPLC-MS实验也证明蛋白样品中含有DAG。在结合HC-070的TRPC5电子密度图中，DAG头部的密度被HC-070替代了，而两条脂肪链尾巴的密度却还保留着。(生物谷Bioon.com）