看不见的大脑活动变得可见？Nat Methods发表突破性活体组织透明技术

当我们试图窥探活体大脑中神经元的活动时，一个根本性的障碍横亘在眼前——组织是不透明的。光在通过生物组织时，会因为内部折射率的不均匀而发生散射，这使得我们无法看清深处正在发生的精细生物过程。传统的光透明技术虽然能让固定后的死组织变得透明，但其使用的化学试剂对活细胞具有毒性，无法应用于研究正常的生理功能。这一长期存在的难题，如今迎来了突破。

近日，在发表于Nat Methods的一项研究中，来自日本的研究团队开发出一种名为 SeeDB-Live的新型光学透明介质，它能在等渗、无毒的条件下，使活体哺乳动物组织变得透明，极大地拓展了荧光成像的深度和应用范围。

寻找无毒的光透明剂：关键在于细胞外折射率匹配

研究团队首先面临的核心问题是：如何在维持细胞正常生理状态（等渗）的前提下，减少光散射？光散射的主要原因是细胞内（折射率约1.363–1.366）与细胞外介质之间的折射率不匹配。因此，理论上可以通过向细胞外液中添加高折射率物质来匹配两者的折射率。

研究人员筛选了多种候选化学物质，通过测量HeLa细胞悬液的透光率发现，活细胞实现最佳透明度的细胞外折射率窗口非常窄，约为1.363–1.369，远低于固定细胞所需的折射率。更重要的是，维持这一折射率的同时，还必须保证溶液的渗透压在生理范围内（约300 mOsm/kg）。

在众多候选物中，牛血清白蛋白（BSA）脱颖而出。作为一种大分子球形蛋白，BSA水溶液渗透压极低。在15–17%（w/v）的浓度下，它能将折射率提升至约1.365，同时渗透压仅增加约2.7 mOsm/kg。这使其成为近乎理想的细胞外折射率匹配剂。研究人员将其命名为SeeDB-Live。

图1 | 用于成像活哺乳动物细胞和组织的无毒光学透明剂的筛选

活体成像验证：从类器官到脑片的深度飞跃

SeeDB-Live的有效性和安全性在多种活体样本中得到了验证。

在由HeLa细胞形成的3D球状体中，使用SeeDB-Live处理后，共聚焦显微镜的成像深度从对照组的约100微米提升至约250微米。对于培养于Matrigel中的小肠类器官，SeeDB-Live同样使其变得透明，并清晰显示了深处表达GCaMP6s钙指示剂的肠内分泌细胞。研究还证实，每天仅4小时的SeeDB-Live处理不会影响这些类器官的正常生长。

在神经科学应用方面，研究人员处理了取自Thy1-YFP-H小鼠的急性脑切片。无论是共聚焦还是双光子显微镜，SeeDB-Live perfusion都将皮层和海马区的成像深度提升了约2倍，使得观察健康、未受损的深层神经元结构成为可能。而此前的方法往往只能观察切片表面机械损伤区域的细胞。

图2 | 使用SeeDB-Live对急性脑切片进行形态学成像的改进

神经功能完好无损：电生理与钙成像的保障

一个关键的问题是，改变细胞外环境是否会影响神经元的核心功能？研究人员对此进行了严谨的评估。

对皮层第五层神经元进行的全细胞膜片钳记录显示，在补偿了液接电位后，SeeDB-Live处理组的静息膜电位、动作电位阈值和发放频率等核心电生理特性与对照组无显著差异。虽然部分参数有轻微变化，但神经元的整体信息输出能力得以保留。

在功能成像层面，使用Thy1-GCaMP6f小鼠的嗅球脑片进行钙成像。结果表明，在优化了SeeDB-Live中的钙、镁离子浓度后，神经元自发活动的频率和幅度与对照组相当。对NMDA刺激的诱发反应也保持一致。更重要的是，在SeeDB-Live的辅助下，深度100微米处的神经元自发活动甚至可以清晰地被单光子共聚焦显微镜捕捉到，而这在通常情况下是双光子显微镜的专属领域。

图3 | 急性脑片中神经元的电生理记录和钙成像

活体应用：清醒小鼠大脑皮层深处的结构与功能

SeeDB-Live的最终目标是用于活体成像。通过在麻醉小鼠的初级体感皮层（S1）上进行开颅并暴露硬脑膜，然后灌流SeeDB-Live，BSA可以渗透至皮层下约500微米。在Thy1-YFP-H小鼠中，深层（600–800微米）第五层锥体神经元的胞体荧光亮度提升了约3倍，其基底 dendrites 和树突棘的形态也清晰可辨。

在行为学层面，对清醒小鼠运动皮层进行SeeDB-Live处理，并未影响其在跑轮上的运动能力、悬挂测试中的运动功能以及日常食物摄入量，且未观察到明显的炎症反应，证实了其体内应用的安全性。

在功能验证上，对小鼠初级视觉皮层（V1）第四层神经元进行视觉刺激，发现SeeDB-Live处理后，神经元对朝向调谐曲线的偏好、反应幅度和选择性指数均得以保持。在嗅球中，SeeDB-Live则增强了对深层僧帽细胞气味反应的检测能力，包括由抑制性输入导致的荧光下降。

拓展成像边界：电压成像的新利器

钙成像速度较慢，无法追踪毫秒级的动作电位。而电压成像虽有高时间分辨率，但信号弱，易受散射干扰。SeeDB-Live带来的透明度提升，为电压成像创造了理想条件。

在急性脑片中，研究人员使用高速电压指示剂Voltron2标记了僧帽细胞。在SeeDB-Live的辅助下，利用宽场荧光成像技术，成功在深度150微米处，无需平均即可单次捕捉到从胞体向树突末梢反向传播的动作电位，并测得其传播延迟约为1.5毫秒。

更令人振奋的是在活体中的应用。通过在Pcdh21-Cre小鼠的嗅球中稀疏表达Voltron2，并结合SeeDB-Live，研究人员在深度90微米的嗅小球层，利用宽场成像同时记录了约140个神经突起（主要为树突）的电压活动。通过分析信号的相关性，可以清晰地将属于同一个嗅小球的神经突起聚类，并进一步根据动作电位的同步性，区分出属于同一颗“姊妹”僧帽细胞的不同树突分支。这一技术首次实现了在活体动物中以单神经元分辨率，对群体神经元的电压动态进行并行记录。

结语

从实验室的培养皿中的细胞球，到离体的脑片，再到活体动物的大脑，SeeDB-Live作为一种真正意义上的、对哺乳动物细胞友好的活体组织光透明剂，正逐步揭开笼罩在生命活动之上的那层迷雾。它不仅将结构成像的触角延伸至更深处，更重要的是，它使得原本受限于信号强度和散射的功能成像，如单光子钙成像和宽场电压成像，得以在深层组织中大放异彩。这为神经科学、发育生物学等领域提供了一把关键的钥匙，开启了在组织、器官尺度上，以更高的分辨率和更丰富的维度，动态观察正常生理过程的大门。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Inagaki S, Nakagawa-Tamagawa N, Huynh NZ, et al. Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo. Nat Methods. Published online March 12, 2026. doi:10.1038/s41592-026-03023-y