安迎锋团队在 Nucleic Acids Research 发表光控 CRISPR 多层级精准基因转录调控新成果

近日，沈阳农业大学生物科学技术学院微生物分子育种团队安迎锋教授课题组在国际权威核酸期刊Nucleic Acids Research（五年影响因子17.6，核酸领域 TOP 期刊）发表题为Multi-level precise regulation of gene transcription in the yeast Saccharomyces cerevisiae based on light-sensitive CRISPR/Cas systems的原创研究论文。博士研究生梁瑶崑为论文第一作者，安迎锋教授为通讯作者。

酿酒酵母是合成生物学、代谢工程领域核心模式底盘细胞，基于 dCas9 的 CRISPRi 工具是构建动态基因回路、精准调控代谢通路的核心元件。现有 CRISPR 调控体系多局限于单一层级调控，普遍存在调控灵敏度不足、本底泄漏、可逆性差等缺陷，且酵母中兼具转录、翻译、蛋白后修饰协同的光控 CRISPR 系统鲜有报道。

针对这一行业痛点，本研究创新整合蓝光响应VPAD-EL222 光遗传元件、L7Ae:k-turn 翻译开关、抗 CRISPR 蛋白（AcrIIA）三类独立调控模块，搭建一套集转录、翻译、蛋白抑制于一体的多层级蓝光可控 CRISPR 基因调控平台，实现酵母靶标基因转录强度高时空、高精度可逆调控。

研究团队分步完成系统设计与迭代优化：首先构建 VPAD-EL222 蓝光转录激活系统，证实 VP16、VP64 两种激活域均可实现蓝光依赖型基因强激活，mEYFP 荧光最高提升 74.64 倍，且调控可逆；进一步引入古菌来源 L7Ae:k-turn RNA 蛋白开关，将光控信号延伸至 dCas9 翻译层级，通过蓝光诱导 L7Ae 表达阻断 dCas9 翻译，缓解 CRISPRi 对报告基因 mCherry 的转录抑制；通过优化 C120 启动子拷贝数、蓝光明暗脉冲周期、不同 k-turn 基序，确定 70 s 亮 / 30 s 暗脉冲光照、Kt-3 RNA 元件为最优调控条件。

基于光敏 CRISPR/Cas 系统的酿酒酵母基因转录多层级精准调控. 摘自Nucleic Acids Research

为进一步放大调控动态范围，团队将广谱抗 CRISPR 蛋白 AcrIIA4 与 L7Ae:Kt-3 系统串联，构建翻译抑制 + 蛋白拮抗双重协同调控回路。实验结果显示，该多层级光控 CRISPR 系统可使 mCherry 荧光强度较黑暗对照组提升2.58 倍（261%），显著优于单一翻译调控或单一抗 CRISPR 调控体系，证明翻译调控与蛋白抑制通路存在协同增效效应。

机制层面证实 AcrIIA4 可竞争性结合 dCas9-sgRNA 复合物，阻断其与靶启动子结合，与 L7Ae 介导的 dCas9 翻译阻抑形成层级化信号放大，大幅提升调控灵敏度与动态区间。

研究同时系统评估蓝光对酵母生长的影响：长时间连续蓝光会诱发氧化应激、抑制菌体增殖，脉冲式光照可平衡调控效果与细胞活性，为发酵放大应用提供关键参数参考。该体系全部元件模块化、可移植，仅通过更换 sgRNA 即可靶向任意酵母内源 / 异源基因，无化学诱导剂依赖，兼具可逆、时空精准、低代谢负担等优势。

本研究首次在酿酒酵母中实现光遗传学介导的转录-翻译-蛋白功能三级协同 CRISPR 调控，突破传统单一层级 CRISPR 调控工具的性能瓶颈，为构建稳健、动态、可编程的合成基因回路提供全新工具箱。

该光控多层级调控平台不仅为解析酵母基因调控网络提供高效研究工具，也为微生物细胞工厂代谢通量精准动态调控、高附加值产物高效合成开辟新思路，在合成生物学、生物制造、微生物分子育种领域具备广阔应用前景。

参考消息：https://academic.oup.com/nar/article/54/14/gkag719/8742446?utm_source=authortollfreelink&utm_campaign=nar&utm_medium=email