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Cell子刊:上海科技大学季泉江团队开发出高效微型CRISPR-SpaCas12f1基因编辑系统

来源:生物世界 2022-09-30 08:07

CRISPR-Cas 系统是目前最常用的基因编辑工具,但是由于传统的 Cas 核酸酶分子量普遍太大,使其在在体基因治疗的应用中受限。

上海科技大学季泉江教授团队在 Cell Reports 发表了题为:Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease 的研究论文。

该论文报道了来自棕榈酸互营单胞菌(Syntrophomonas palmitatica)的 Cas12f1(SpaCas12f1)的生化特征及其 DNA 切割机制,证明 CRISPR-SpaCas12f1 系统能在细菌中实现多种编辑目的,且通过工程化向导 RNA 使该系统转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。

CRISPR-Cas 系统是目前最常用的基因编辑工具,但是由于传统的 Cas 核酸酶分子量普遍太大,使其在在体基因治疗的应用中受限。

 

近年来,为了解决这一难题,小型 Cas 核酸酶逐渐被发现和探究。其中,Cas12f 核酸酶是目前最紧凑的 CRISPR 效应核酸酶,比传统 Cas9  和Cas12a 核酸酶小一半以上,在临床治疗应用中具有巨大潜力,然而高效的 Cas12f 基因编辑系统仍旧较少。

2021年9月,季泉江团队在 Nature Chemical Biology 期刊发表了题为:Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease 的研究论文。系统性表征了一种极小型CRISPR核酸酶——AsCas12f1(仅422个氨基酸)的 DNA 识别和切割机制,并探究了它作为一种新型基因编辑工具的可能性,成功在细菌和哺乳动物细胞中实现了高效的基因编辑。

 

在这篇 Cell Reports 论文中,季泉江团队发掘了来自 Syntrophomonas palmitatica 的紧凑型 SpaCas12f1,只有497个氨基酸,该研究首先系统地表征了 SpaCas12f1 的生化特性及对 DNA 识别与切割的模式,证明了 SpaCas12f1 是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶,可在 tracrRNA 和 crRNA 的帮助下有效切割含有5' -NTTY(Y代表C或T)PAM 的双链 DNA。此外,SpaCas12f1 拥有与 AsCas12f1 相似的切割模式,即在靶向链上引入一个切口,非靶向链上引入两个切口。

CRISPR-SpaCas12f1的表征与改造

 

由于 SpaCas12f1 在大肠杆菌中拥有质粒干扰活性,为探究其能否成为一个在细菌中高效的基因组编辑工具,研究团队通过引入 SpaCas12f1 和 Lambda Red 重组酶系统及单链修复模板,实现了 CRISPR-SpaCas12f1 在大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中多种精准的基因组编辑。

同时,研究团队发现 SpaCas12f1 的 tracrRNA 具有独特的 head-to-toe 的发夹结构,这是限制 SpaCas12f1 在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对 RNA 二级结构预测及小 RNA 测序结果分析,研究团队设计了五种策略,系统地工程化向导 RNA,成功地获得了高效的引导 RNA,gRNA_MS13,从而实现 CRISPR-SpaCas12f1 高效哺乳动物细胞编辑。

这项研究扩展了微型 CRISPR 核酸酶工具库,并为基因治疗和工程化微型CRISPR系统提供了新的思路。

上海科技大学季泉江团队博士生王玉珏为第一作者,上海科技大学季泉江教授与助理研究员吴兆韡为本文的共同通讯作者。该研究得到了临港实验室求索杰出青年基金、基金委优秀青年基金、面上项目、上海市科委原创探索项目等基金的支持。

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