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2021年8月CRISPR/Cas最新研究进展

  1. CRISPR
  2. Craspase
  3. crRNA

来源:本站原创 2021-08-31 12:10

2021年8月31日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。2020年10月,德国马克斯-普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士因在CRISPR-Cas9基因编辑方面做

2021年8月31日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。2020年10月,德国马克斯-普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士因在CRISPR-Cas9基因编辑方面做了的贡献荣获2020年诺贝尔化学奖。

CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。


图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。

2018年11月26日,中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改,使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵,引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究,但是更多的是质疑,甚至是谴责。

即将过去的8月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻,供大家阅读。

1.Science:重大进展!发现一种新型的切割RNA的III型CRISPR-Cas系统
doi:10.1126/science.abk2718


在一项新的研究中,荷兰代尔夫特理工大学的Stan Brouns博士及其研究团队发现了一种新型的可以切割RNA的III型CRISPR-Cas系统。这一发现预计将为基因研究和生物技术的新应用开发提供许多机会。相关研究结果于2021年8月26日在线发表在Science期刊上,论文标题为“The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase”。

在这项新的研究中,这些作者描述了来自Candidatus “Scalindua brodae”的III-E型效应物,称为Sb-GRAMP,它由一个具有几个III型结构域融合在一起的单个基因天然编码。这种效应物使用CRISPR RNA(crRNA)来引导靶RNA的识别,并在相隔6个核苷酸的两个确定的位置切割单链RNA。耐人寻味的是,Sb-GRAMP与caspase-like TPR-CHAT肽酶物理结合,形成Craspase(CRISPR引导的Caspase)复合物,从而提出了靶RNA诱导蛋白酶活性以获得病毒免疫的潜在机制。


图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abk2718。

Brouns说,“自2006年以来,我们一直试图了解CRISPR-Cas系统,并且不断发现CRISPR-Cas的新变体,可以用于重要的应用。例如,CRISPR-Cas9允许对细胞中的DNA进行非常精确的编辑。这在研究界掀起了一场真正的革命,例如在研究遗传性疾病方面。CRISPR-Cas系统也被证明是众所周知的PCR检测冠状病毒的一种令人关注的替代选择。我们如今发现的这种新的III型CRISPR-Cas系统不是在DNA上起作用,而是在RNA上起作用,这提供了一系列新的可能性。”

2.Nucleic Acids Res:利用I-F型CRISPR-Cas系统高效编辑超级细菌
doi:10.1093/nar/gkab521


在一项新的研究中,来自中国香港大学的研究人员开发出一种可转移的整合的基于I型CRISPR的平台,它可以有效地编辑铜绿假单胞菌的不同临床分离株,其中铜绿假单胞菌是能够感染多种组织和器官的超级细菌,是院内感染的主要来源。该技术可以加速识别多药耐药(MDR)病原体的耐药性决定因素,并开发新的抗耐药性策略。相关研究结果近期发表在Nucleic Acids Research期刊上,论文标题为“A transferrable and integrative type I-F Cascade for heterologous genome editing and transcription modulation”。论文通讯作者为香港大学理学院分子与细胞生物学研究部副教授Aixin Yan博士。

此前,Yan博士及其团队在临床多药耐药的铜绿假单胞菌菌株PA154197中发现了一种高度活跃的I-F型CRISPR-Cas系统,其中该菌株是从香港玛丽医院的一个血流感染病例中分离出来的。他们对这一CRISPR-Cas系统进行了表征,并在这种天然的I-F型CRISPR-Cas系统的基础上成功开发了适用于这种MDR分离株的基因组编辑方法。该方法使快速鉴定MDR临床分离株的耐药性决定因素和开发新的抗耐药性策略成为可能(Cell Reports, 2019, 29, 1707-1717)。

为了克服将这种复杂的I型Cascade转移到异源宿主的障碍,在这项研究中,Yan团队将整个I-F型cas 操纵子克隆到精通整合的载体mini-CTX中,并通过接合(一种自然界中常见的DNA转移方法)将它递送到异源宿主。mini-CTX载体能够将整个Cascade整合到异源宿主基因组中保守的attB基因座上,使它们能够容纳一种能够稳定表达和发挥作用的天然I-F型CRISPR-Cas系统。他们发现,与可转移的CRISPR/Cas9系统相比,转移的I-F型Cascade显示出明显更强的DNA干扰能力和更高的菌株稳定性,并可被用于基因组编辑,效率高(>80%)且简单,即通过一步转化单一编辑质粒即可实现。

3.Science:新技术可在体内快速进行大规模CRISPR筛选
doi:10.1126/science.abi8870


作为一种小型的快速生长的生物,斑马鱼与人类具有很多相同的基因。斑马鱼对许多生物学家来说很重要,因为他们发现斑马鱼非常适合研究一系列问题,从有机体如何发育到神经系统如何驱动行为。如今,在一项新的研究中,来自美国犹他大学、布莱根妇女医院、哈佛医学院和麻省总医院的研究人员开发出一种名为MIC-Drop的新技术,这种技术可使斑马鱼在大规模基因研究方面将变得更加强大。相关研究结果于2021年8月19日在线发表在Science期刊上,论文标题为“MIC-Drop: A platform for large-scale in vivo CRISPR screens”。论文通讯作者为犹他大学药理学与毒理学学系化学生物学家Randall Peterson博士。

MIC-Drop(Multiplexed Intermixed CRISPR Droplets, 多重混合CRISPR液滴)通过将CRISPR系统的组分包装成微观的油包液滴来解决这个问题,这些油包液滴可以在不混合其内含物的情况下混合在一起。为了用MIC-Drop对许多基因进行筛选,Peterson团队首先构建出一个gRNA文库。每个gRNA与Cas9酶一起被包装在自己的液滴中。为了跟踪靶基因,每个油包液滴还包括一个识别其内含物的DNA条形码。


MIC-Drop是一种基于crispr的新技术,可以快速有效地筛选斑马鱼中数百个基因的功能,以更好地了解人类健康和疾病。图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abi8870。

Peterson团队对油包液滴的化学成分进行了微调,以确保它们保持稳定和离散性,因此针对不同基因设计的油包液滴可以混合在一起并装入同一针头。在显微镜下,MIC-Drop使用者将单个油包液滴注射到斑马鱼胚胎中,然后转到下一个胚胎并注射下一个油包液滴。这个过程可以重复数百次,向每个胚胎提供一套CRISPR组分,因此在每个胚胎中,该系统都能灭活单个基因,然后这些作者监测对斑马鱼的潜在影响。

为了展示MIC-Drop的潜力,这些作者测试188个不同的斑马鱼基因在心脏发育中的潜在作用。在构建针对这些基因的gRNA并将CRISPR系统引入数百个斑马鱼胚胎后,他们发现有一些斑马鱼在成熟后出现了心脏缺陷。利用这些斑马鱼体内的DNA条形码,他们能够将这些缺陷追溯到13个不同基因的失活。由于斑马鱼和人类基因之间的相似性,这一发现可能指向人类心脏发育中以前未知的方面。

4.Mol Cell:利用CRISPR筛选技术或有望识别出治疗急性髓性白血病的新型药物靶点
doi:10.1016/j.molcel.2021.07.018


急性白血病的转化状态需要一定的基因调节程序,而这些程序主要涉及转录因子和染色质调节子。近日,一篇发表在国际杂志Molecular Cell上题为“ZMYND8-regulated IRF8 transcription axis is an acute myeloid leukemia dependency”的研究报告中,来自宾夕法尼亚大学等机构的科学家们通过研究发现,利用CRISPR筛选工具或能识别出一种治疗性靶点来治疗急性髓性白血病(AML),相比当前疗法而言,这或许有望给患者带来更少的副作用,这种名为ZMYND8的靶点或许并不是一种突变基因,而是一种表观遗传调节蛋白,癌细胞需要其来控制对癌细胞存活和生长非常关键的基因表达。

研究者Junwei Shi说道,如今我们已经发现,AML患者机体的癌细胞严重依赖于ZMYND8,而且多亏这种复杂的基于CRISPR的筛选方法,我们才能够确定具体的可作为药用的靶点。本文研究结果表明,提供抵御ZMYND8的药物抑制剂或能破坏AML易感基因调节回路,这或许是一个开发比当前治疗方法更好的精准医学化合物的机会,从而就能治疗血液癌症,而这恰恰是研究人员目前正在研究的领域。

文章中,研究人员利用CRISPR技术精确破坏了癌细胞中蛋白质的结构域功能,同时绘制出了其分子功能图谱,并对其修饰用于小鼠模型的研究,结果发现,抑制小鼠机体中ZMYND8的表观遗传阅读功能或能使得小鼠机体的肿瘤更小且生存率更高。此外,研究人员还发现了一种新型生物标志物,即来自AML细胞的基因IRF8的表达水平或表观遗传学状态,利用该生物标志物,研究人员就能预测癌细胞对ZMYND8抑制剂的敏感性。此外,研究者还利用在宾夕法尼亚大学医学院接受治疗的病人的血液样本验证了IRF8的高表达和IRF8增强子DNA元件的存在,从而就支持了其研究发现。

5.Nat Biomed Eng:重磅!科学家成功开发出了一种有望治疗阿尔兹海默病的新型全脑基因组编辑技术!
doi:10.1038/s41551-021-00759-0


家族性阿尔兹海默病是由编码淀粉样β前体蛋白(app)的基因以及编码早老蛋白1(presenilin 1)和早老蛋白2(presenilin 2)的基因发生显性突变所引发,其病理学特征是在多个大脑区域中出现细胞外淀粉样斑块和细胞内的神经纤维缠结。近日,一篇发表在国际杂志Nature Biomedical Engineering上题为“Brain-wide Cas9-mediated cleavage of a gene causing familial Alzheimer’s disease alleviates amyloid-related pathologies in mice”的研究报告中,来自中国香港科技大学等机构的科学家们通过研究利用全脑基因组编辑技术开发出了一种新技术,其或能减少遗传修饰的阿尔兹海默病小鼠模型机体的阿尔兹海默病病理学表现,这项先进的技术或许还具有巨大的潜力,来转化为一种新型的长效策略来治疗阿尔兹海默病患者。

这篇研究报告中,研究人员开发了一种新型的基因组编辑技术,其不仅能够跨越血脑品章,还能将优化的基因组编辑工具运输到整个大脑中,利用这种新设计的基因组编辑运输工具,这种新技术就能通过单一无创的静脉注射从而实现高效的全脑基因组编辑,而且这还能有效地破坏阿尔兹海默病小鼠模型中引起家族性阿尔兹海默病的突变,并能够改善整个大脑中阿尔兹海默病的疾病症状,同时还能为后期开发新型治疗性策略提供思路。


设计和验证CRISPR-Cas9介导的基因组编辑从而破坏突变的APPswe等位基因。图片来源:Duan, Y.,et al. Nat Biomed Eng (2021). doi:10.1038/s41551-021-00759-0。

同时,研究人员还在小鼠模型中发现,在治疗后6个月(约为小鼠模型正常寿命的三分之一),小鼠模型机体中的淀粉样蛋白的水平仍然很低,淀粉样蛋白被认为是能驱动阿尔兹海默病患者的神经变性的一种特殊蛋白,这就表明,这种单次注射的基因组编辑策略或许具有持久的治疗性效果,更重要的是,截止到目前为止,其在小鼠机体中并未出现任何副作用。研究者说道,作为首次展示的高效的全脑基因组编辑来减缓整个大脑的阿尔兹海默病疾病症状,这或许的确是一项让人兴奋的研究结果,这项研究工作是利用基因组编辑技术来治疗遗传性大脑疾病的一个重要的里程碑,其有助于帮助开发针对遗传性神经变性疾病形式的精准医学技术。

6.Cell子刊:经过化学修饰的gRNA可将CRISPR-Cas13在人细胞中的靶向效率提高2至5倍
doi:10.1016/j.chembiol.2021.07.011


在一项新的研究中,美国纽约大学和纽约基因组中心的Neville Sanjana博士及其团队为靶向RNA而不是DNA的CRISPR系统开发出经过化学修饰的向导RNA(gRNA),这是拓展基因修饰及其表达水平的最新努力。这些经过化学修饰的gRNA极大地增强了在人类细胞中靶向---追踪、编辑和/或敲降(knockdown)---RNA的能力。相关研究结果于2021年8月2日在线发表在Cell Chemical Biology期刊上,论文标题为“Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas13 knockdown in human cells”。


图片来自Cell Chemical Biology, 2021, doi:10.1016/j.chembiol.2021.07.011。

在这项新的研究中,这些作者探索了一系列不同的经过修饰的gRNA,并详细说明了相比于未经过化学修饰的gRNA,经过化学修饰的gRNA如何将CRISPR-Cas13系统的靶向效率提高2至5倍。他们还发现,优化的化学修饰将CRISPR-Cas13的靶向活性从48小时延长到4天。他们与来自Synthego公司和新英格兰生物实验室(New England BioLabs)的科学家们合作,形成了一个具有酶纯化和RNA化学专业知识的多样化研究团队。为了应用这些优化的化学修饰,他们靶向来自健康供者的人类T细胞中的细胞表面受体和RNA病毒SARS-CoV-2的所有已知变体都具有的基因序列的“通用”片段。

Sanjana实验室之前的研究概述了针对CRISPR-Cas13的最佳gRNA设计原则,并于2020年3月发表在Nature Biotechnology期刊上(Nature Biotechnology, 2021, doi:10.1038/s41587-020-0456-9)。在此基础上,这些作者在这项新的研究中系统地应用和测试了多种化学修饰。例如,他们发现,在人类细胞系中,在gRNA中添加三个用不同类型的化学键相互连接的碱基(硫代磷酸修饰)对RNA靶标的敲降能力延长了数天。在原代T细胞中,这种硫代磷酸修饰将CD46(一种参与免疫系统调节的受体)的表达敲降了60%~65%,而在使用未经过修饰的gRNA时仅将CD46表达敲降了40%~45%。

这些作者还发现,某些甲基化和反向终止修饰(inverted terminator modification)也能提高Cas13的活性。对于所有的化学修饰而言,受到修饰的RNA碱基所在的位置也很关键。当放置不正确时,这些修饰导致gRNA不能发挥作用。论文共同第一作者、Sanjana实验室博士后研究员Hans-Hermann Wessels说,“我们希望这些针对CRISPR-Cas13的经过化学修饰的gRNA的有效性和稳定性的提高将有助于为靶向RNA的CRISPR酶在原代细胞中的使用铺平道路。”

7.Nat Chem Biol:使用两种CRISPR酶,无需扩增,就可在20分钟内高灵敏地检测SARS-CoV-2
doi:10.1038/s41589-021-00842-2


频繁、快速地检测COVID-19对于控制疫情的蔓延至关重要,尤其是在出现新的、更具传播性的SARS-CoV-2病毒变体时。虽然如今金标准的COVID-19诊断测试使用qRT-PCR---定量逆转录聚合酶链式反应---非常敏感,可以检测到每微升一个RNA拷贝,但它需要专门的设备、几个小时的运行时间和一个集中的实验室设施。因此,测试通常需要至少一到两天的时间。

在一项新的研究中,由美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna、David Savage和Patrick Hsu领导的一个研究团队开发出一种比qRT-PCR更快速、更容易部署的诊断测试方法。它如今结合了两种不同类型的CRISPR酶,以构建一种可以在不到一小时内检测出少量病毒RNA的测试方法。相关研究结果于2021年8月5日在线发表在Nature Chemical Biology期刊上,论文标题为“Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases”。虽然这种新技术还没有达到与qRT-PCR的灵敏度---可以检测到每微升液体中仅有的几个病毒拷贝---相媲美的阶段,但它能够检测到的病毒RNA水平---大约每微升液体30个病毒拷贝---足以用于监测人群和限制感染的传播。

Savage说,“鉴于这种测试方法足够方便和快速,你不需要PCR的灵敏度,就能在社区中基本捕捉和诊断COVID-19。我们希望将生物化学尽可能地推进到你可以想象一种非常方便的形式,在一个环境中,你可以每天接受测试,比如说,在上班的入口处。”

8.eLife:利用CRISPR-Cas9进行起始密码子中断有望治疗富克斯角膜营养不良
doi:10.7554/eLife.55637


在一项新的研究中,来自美国俄勒冈大学、弗吉尼亚大学、犹他大学、马萨诸塞大学医学院和约翰霍普金斯大学的研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑技术中断起始密码子,以阻止小鼠的富克斯角膜营养不良(Fuchs' corneal dystrophy)。这是首次证明使用这种称为起始密码子中断(start codon disruption)的技术来治疗有丝分裂后组织所患的遗传疾病,并有潜力通过取代角膜移植的需求而引发富克斯角膜营养不良治疗变革。它还可能导致针对其他遗传疾病甚至影响非生殖细胞的疾病的新疗法。相关研究结果近期发表在eLife期刊上,论文标题为“Start codon disruption with CRISPR/Cas9 prevents murine Fuchs’ endothelial corneal dystrophy”。论文通讯作者为俄勒冈大学的Balamurali Ambati教授。

论文第一作者、Ambati实验室研究员Hironori Uehara开发了一种创新手段,通过靶向COL8A2基因的起始密码子来阻断它的表达。起始密码子是蛋白质合成的起始位点。破坏起始密码子可导致蛋白质表达的终止。靶向其他位点也可以通过移码终止蛋白质的表达,但它可能诱发其他不需要的蛋白质表达。位于起始密码子下游越远的密码子,发生错义突变的风险越大,有可能产生活性未知的突变蛋白。


图片来自Pixabay/CC0 Public Domain。

这些作者通过将编码酿脓链球菌Cas9(SpCas9)和向导RNA(gRNA)的腺病毒注射到直接面对角膜内皮细胞的小鼠眼睛前房进行治疗。在检查这种治疗的安全性的研究中,他们确定周围组织没有受到基因治疗的影响。他们研究了其他的非靶基因,以确保它们没有受到影响,并确定最大耐受剂量对视网膜、虹膜和眼睛的其他部分是安全的。

这些作者发现,他们的方法不仅可以保留角膜内皮细胞的密度和结构,而且还可以拯救它们的功能。在诱发肿胀的功能拯救试验中,他们对角膜有了一些令人惊讶的发现。在角膜上加水并没有像科学家们预期的那样诱发肿胀。相反,他们确定肿胀是由眼房水通过角膜内皮(角膜的背面)进入角膜而诱发的,因此,在摘除上皮后角膜表面的高渗溶液挑战导致了最大的角膜肿胀。

9.Science子刊:在家就可快速准确地检测唾液中的新冠病毒及其变体
doi:10.1126/sciadv.abh2944


如今,在一项新的研究中,来自美国哈佛大学威斯生物启发工程研究所、麻省理工学院和波士顿地区几家医院的研究人员开发出一种廉价的、基于CRISPR的诊断测试,允许用户在家里使用唾液样品对自己进行SARS-CoV-2及其多种病毒变体的测试,而不需要额外的仪器。相关研究结果发表在2021年8月6日的Science Advances期刊上,论文标题为“Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants”。

这种称为Minimally Instrumented SHERLOCK(miSHERLOCK)的诊断设备易于使用,提供的结果可在一小时内由配套的智能手机应用程序读取和验证。它在实验中成功区分了SARS-CoV-2的三种不同变体,并且可以迅速重新配置以检测更多的变体,如Delta变体。该设备可以用三维打印机和常见的部件组装,价格约为15美元,重复使用这些部件使单个检测的成本降至6美元。

论文共同第一作者、哈佛大学威斯生物启发工程研究所和麻省理工学院的博士后研究员Helena de Puig说,“miSHERLOCK消除了将患者样品运送到集中测试地点的需要,并大大简化了样品制备步骤,使患者和医生能更快、更准确地了解个人和社区的健康状况,这在不断发展的大流行病中至关重要。”

10.Science:重大进展!CRISPR先驱张锋利用人类蛋白质开发出新型mRNA递送平台,助推基因疗法开发
doi:10.1126/science.abg6155


在一项新的研究中,来自美国麻省理工学院、麦戈文脑科学硏究所、霍华德-休斯医学研究所和布罗德研究所的研究人员开发出一种向细胞递送分子药物的平台。该平台被称为SEND,可以经编程后封装和递送不同的RNA货物。SEND利用体内的天然蛋白质形成类似病毒的颗粒并结合RNA,而且它可能比其他递送方式引起的免疫反应更少。相关研究结果发表在2021年8月20日的Science期刊上,论文标题为“Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery”。

这种新的递送平台在细胞模型中有效地发挥作用,并且随着进一步的开发,可能为广泛的分子药物---包括那些用于基因编辑和基因替换的分子药物---开辟一类新的递送方法。针对分子药物的现有递送工具可能效率低下,并随机整合到宿主细胞的基因组中,而且有些可能刺激不必要的免疫反应。SEND有希望克服这些限制,这可能为部署分子药物开辟新的机会。


完全组装好的SEND保护囊从细胞中释放出来,经收集后可用于基因疗法,图片来自McGovern Institute。

在这篇新的论文中,张锋及其研究团队描述了SEND(Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery, 选择性内源性封装用于细胞递送)如何利用人类细胞制造的分子。SEND的中心是一种叫做PEG10的蛋白质,它通常与自身的mRNA结合,并在其周围形成球形的保护囊。在他们的研究中,他们设计了PEG10来选择性地包装和递送其他RNA。他们利用SEND将CRISPR-Cas9基因编辑系统递送给小鼠细胞和人类细胞,以编辑靶基因。

为了开发SEND技术,张锋团队确定了编码PEG10的mRNA中的分子序列,或者说“信号”,PEG10识别该信号并用于包装它自身的mRNA。然后,他们利用这些信号对PEG10 mRNA和其他RNA货物进行设计,使PEG10能够选择性地包装这些RNA。接下来,他们用额外的称为fusogen的蛋白质装饰PEG10保护囊,其中fusogen在细胞表面上发现,帮助细胞融合在一起。

通过设计PEG10保护囊上的fusogen,张锋团队应该能够将PEG10保护囊靶向特定类型的细胞、组织或器官。作为实现这一目标的第一步,他们使用了两种不同的fusogen,包括在人体中发现的一种,以实现SEND货物的递送。Zhang说,“通过混合和匹配SEND平台中的不同成分,我们相信它将为开发不同疾病的治疗方法提供一种模块化平台。”(生物谷 Bioon.com)

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