Nucleic Acids Research：NOVA2调控神经CircRNA生物发生

环状RNA(CircRNAs)在大脑中高度表达，在神经元分化过程中其表达增加。在发育中的小鼠大脑中调节环状RNA的因素是未知的。NOVA1和NOVA2是神经丰富的RNA结合蛋白，在选择性剪接中的作用得到了很好的描述。从RNA-seq数据中提取的CircRNA图谱显示，在Nova2基因敲除小鼠的胚胎皮质中，全局CircRNA水平降低，但在Nova1基因敲除小鼠中没有。对分离的缺乏NOVA2的抑制性和兴奋性皮层神经元的分析显示，CircRNA的减少更加显著，并确立了NOVA2在促进CircRNA生物发生中的广泛作用。为了研究控制NOVA2调控CircRNA生物发生的顺式元件，作者构建了一个基于Efnb2基因的反向剪接报告。作者发现，当位于内含子两侧的Yca Y簇被诱变时，NOVA2介导的CircEfnb2的反向剪接受到损害。CLIP(交联和免疫沉淀)和其他报告分析证明了位于CircRNA位点两侧内含子的NOVA2结合位点的重要性。NOVA2是第一个被发现在发育中的大脑中全球促进CircRNA生物发生的RNA结合蛋白。

图片来源：https://doi.org/10.1093/nar/gkab523

选择性剪接(AS)影响95%的人类多外显子基因。通过AS，数十万种具有不同结构属性、定位模式和翻译效率的RNA异构体可以表达为具有不同功能的蛋白质异构体。在哺乳动物的神经系统中，AS尤其普遍和高度保守。在大脑发育过程中，AS负责在特定的阶段建立神经元特异的剪接模式，而发育调节的替代外显子在突触形成、神经元迁移和轴突引导中起着重要作用。发育过程中特定阶段的AS模式是由在神经元中丰富或特异表达的RNA结合蛋白(RBPs)控制的，对正常发育至关重要，因为它们的失调是许多神经疾病的基础。

环状RNA(CircRNA)是通过反向剪接产生的，这是AS的一种。在反向剪接过程中，下游的5’剪接位点(SS)与上游的3’产生抗外切核糖核酸酶的闭环‘圈’的环化外显子的SS。最具特征性的CircRNA来源于蛋白质编码基因的注释外显子，许多外显子独立于宿主基因调节，并在不同的时间点表现出独特的表达模式。到目前为止，人们认为CircRNA的功能包括隔离microRNAs、翻译小肽、调节免疫反应、运输和支架限制性商业惯例。CircRNA在全基因组水平上富集于脑组织中，并在神经分化和成熟过程中显著上调。作者还发现CircRNAs在衰老过程中会积聚，这种趋势似乎只出现在脑组织和神经元中。大脑表达的CircRNA的功能意义正在显现，只有少数CircRNA被发现在神经系统中发挥作用。

已确定了几种限制性商业惯例来调节CircRNA的生物发生，包括蝇眼、颤栗(QKI)、ADAR、FUS以及几种hnRNPs和SR蛋白。然而，从活体脑或神经元数据集缺乏限制性商业惯例对CircRNA调控的研究。有几个特征明确的剪接因子在神经系统中起作用，包括RBFOX1/2/3、PTPBP1/2、nrSR100/SRRM4、Hu蛋白和NOVA1/2。这些剪接因子中任何一个的缺失或失调都会导致严重的、往往是致命的神经缺陷。最具特征性的神经丰富剪接因子是nov A蛋白，它最初被发现是副肿瘤性视阵挛肌阵挛共济失调患者的自身抗原，这是一种以运动和认知缺陷为特征的神经系统疾病。Nov A1和Nov A2是与Yca Y基序簇结合以调节AS的类似物。在小鼠中，任何一种基因敲除(KO)都会导致早期死亡。这归因于NOVA1缺乏症中运动神经元的死亡，以及皮层和浦肯野神经元在N O VA2中的异常迁移。虽然这两种蛋白质识别相同的RNA结合基序，但它们的表达在很大程度上是相互的。例如，免疫组织化学和原位杂交数据显示NOVA2在中脑和脊髓低表达，而在皮层和海马高表达。相反，nov a1在中脑和脊髓高表达，在皮层相对低表达。此外，NOVA1和NOVA2似乎控制着发育中皮层中不同的剪接调控网络。最近，兴奋性(Emx1+)或抑制性(GAD2+)神经元中NOVA2的条件性敲除(CKO)导致了数以千计的AS事件，这些事件在很大程度上是每种细胞类型所独有的。此外，兴奋性神经元中NOVA2的丢失导致皮层和海马层结构的紊乱，而NOVA2-KO抑制神经元中未观察到这种情况。这些发现显示了在不同神经元亚型中检查AS结果的重要性。

人工后拼接报告的示意图

图片来源：https://doi.org/10.1093/nar/gkab523

为了构建人工CircMini-WT载体，将含有全长GFP编码序列、部分人ZKSCAN1内含子序列和部分Mboat2内含子序列的两个gBlock克隆到上述改进的pUC19载体中。作者使用默认设置的伯克利果蝇基因组计划剪接预测工具来指导GFP和内含子序列的修改，这将提高剪接效率并防止意外剪接产物的产生。此外，现有的YCA Y基序也发生了突变，以阻止Nov A2结合。人工10x YCA Y序列通过gBlock产生，并被克隆到与CircRNA基因座相关的50bp上游(pMini-up)、49bp下游(PMiniDown)或两个位置(pMini-Both)。（生物谷 Bioon.com）

参考文献

David Knupp et al. NOVA2 regulates neural circRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. doi.org/10.1093/nar/gkab523