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人脐带间充质干细胞源外泌体对缺氧条件下RPE细胞生物学特性的影响

来源:中华眼科杂志 2020-05-11 12:31

 

为了探讨人脐带间充质干细胞(HUMSC)外泌体对缺氧条件下人视网膜色素上皮(RPE)细胞的增殖、凋亡及迁移生物学特性的影响,北京大学人民医院徐宁达, 黄旅珍等人采用组织块贴壁培养法原代培养HUMSC,扩增传代至第4代,流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物;收集培养第4代HUMSC无血清培养基,分离提取外泌体,在电镜下观察其超微结构并用免疫印迹法鉴定其CD63、CD9蛋白表达;体外培养RPE细胞用噻唑蓝(MTT)法检测缺氧0、1、2、3、4、5 d的细胞增殖情况;用细胞划痕实验检测缺氧0、24、48、72 h的细胞迁移情况,并结合细胞凋亡实验确定缺氧时间。处于生长旺盛期的RPE细胞分为5个组,分别为对照组、缺氧组及不同剂量外泌体预处理组(100、200、300 μg/ml),培育48 h后采用MTT法观察各组细胞的增殖能力,Annexin V/碘化丙啶(PI)双染流式细胞术观察细胞凋亡,细胞划痕实验中观察各组细胞的迁移功能。

结果发现,流式细胞仪检测第4代HUMSC的表面标志CD105、CD73、CD90呈强阳性表达,体外诱导成脂和成骨细胞,提示分离培养的HUMSC具有MSC特异性表型。分离的外泌体经扫描电镜观察可见大小不一的球状膜性结构,且免疫印迹法结果提示CD63、CD9呈阳性表达。体外培养RPE在缺氧0、1、2、3、4、5 d用MTT法检测细胞增殖结果:与对照组比较,吸光度(A)值差异均有统计学意义,前2 d随缺氧时间延长,RPE细胞的增殖能力逐渐增强(A值为1.862±0.135和2.278±0.244);3 d后RPE细胞的增殖能力逐渐减弱(A值为1.419±0.124和1.599±0.156)。细胞划痕实验结果:随着缺氧时间的延长,RPE细胞迁移距离逐渐增加,至72 h全部长满且无缝隙。RPE细胞凋亡实验检测结果:缺氧前2 d,随缺氧时间延长细胞凋亡数量有差别[3.628%±1.348%、20.123%±1.183%],3 d时细胞凋亡数量较多(42.290%±3.217%),与2 d比较差异有统计学意义。缺氧48 h后MTT法检测细胞增殖结果:与对照组(1.870±0.499)比较,缺氧组(2.616±0.307)细胞增殖数显着增加(t=-3.116,P<0.05);与缺氧组比较,外泌体预处理组细胞增殖数减少(2.041±0.115、1.931±0.205、1.929±0.025)(t=-4.290,-4.547,-5.286;P<0.01),外泌体各剂量组之间差异无统计学意义(F=1.181,P>0.05)。采用Annexin V/PI双染流式细胞仪观察细胞凋亡结果:与对照组(1.180%±0.689%)比较,缺氧组细胞凋亡数(19.273%±1.194%)显着增加(t=-32.141,P<0.01);与缺氧组比较,外泌体预处理组的细胞凋亡数显着减少(12.318%±1.087%、11.878%±1.348%、11.090%±1.716%;t=-10.547,-10.057,-9.589;P<0.01),外泌体各剂量组之间差异无统计学意义(F=1.173,P>0.05)。细胞划痕实验结果:与对照组比较,缺氧组细胞迁移距离显着增加;与缺氧组比较,外泌体预处理组细胞迁移距离减小(t=11.766,10.770,11.311;P<0.01],外泌体各剂量组之间差异无统计学意义(F=1.179,P>0.05)。

本研究发现HUMSC外泌体可有效抑制缺氧状态下人RPE细胞增殖、凋亡及迁移,为寻找缺氧导致RPE相关疾病的研究和治疗提供理论依据。(生物谷Bioon.com)

 

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