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癌相关成纤维细胞来源的外泌体在促骨肉瘤侵袭转移中作用

来源:中华解剖与临床杂志 2020-03-26 12:29

 

为了探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源的外泌体对骨肉瘤侵袭及转移的影响,山西医科大学第二临床医学院等陈成龙人利用人源骨肉瘤细胞株Saos-2采用差速贴壁法分离、培养CAFs,显微镜下观察CAFs的形态,免疫组织化学观察α-SMA蛋白表达对CAFs进行鉴定。培养CAFs,采用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒分离外泌体。通过透射电镜观察外泌体形态,Western blot检测外泌体特异性标记蛋白β-actin、CD63表达情况对外泌体进行鉴定。培养人源骨肉瘤细胞株Saos-2,分为外泌体组和对照组,采用细胞划痕及Transwell小室实验观察外泌体对Saos-2细胞迁移和侵袭能力的影响。选取一级5周龄BALB/c-nu雌性裸鼠12只,按编号随机分为外泌体组和对照组,每组6只。两组均采用皮下移植成瘤法在裸鼠右侧背部皮下接种人骨肉瘤Saos-2细胞与Matrigel基质胶混合悬液,建立裸鼠骨肉瘤肿瘤模型。造模结束后即刻进行尾静脉注射:外泌体组每只裸鼠通过尾静脉注射浓度为0.1 μg/μL的外泌体悬液30 μL,对照组裸鼠尾静脉注射等量生理盐水,两组均1次/周,共注射6次。第1次注射后每日观察裸鼠成瘤情况,从裸鼠右侧背部皮下可触及肿块开始,测量两组裸鼠肿块的最长径和最长径的最大垂直短径,计算肿瘤体积,此后每周测量1次,共测量6次。完成最后一次测量后腹腔麻醉断椎法处死裸鼠,完整取出肿块并称重。取裸鼠肺组织进行切片HE染色观察两组裸鼠肺转移情况。

结果显示:显微镜下观察CAFs呈长梭形,排列杂乱,无方向性;细胞免疫组织化学染色结果显示:CAFs的α-SMA蛋白表达阳性,提示CAFs提取成功。电镜观察外泌体呈70~100 nm圆形或椭圆形膜性囊泡状结构;Western blot结果显示外泌体中CD63蛋白呈高表达,β-actin蛋白表达较弱,提示成功分离CAFs来源外泌体。细胞划痕实验、侵袭实验结果显示:外泌体组细胞迁移距离、迁移率、侵袭细胞数目分别为(0.19±0.02)mm、0.81%±0.11%、(53.67±5.69)个,均高于对照组的(0.81±0.11)mm、0.32%±0.11%、(31.67±8.08)个,差异均有统计学意义(t=6.209、6.209、3.856, P值均<0.01)。外泌体组和对照组12只裸鼠采用皮下移植成瘤法接种人骨肉瘤Saos-2细胞与Matrigel基质胶混合悬液,均造模成功,实验过程中无一例动物死亡。两组裸鼠均于第1次注射肿瘤细胞后1周触及肿块,肿瘤体积均随着时间的延长明显增大,差异均有统计学意义(F=49.428、8.477, P值均<0.05)。两组间比较,第1、2次测量肿瘤体积,差异均无统计学意义(P值均>0.05);而第3~6次测量肿瘤体积,外泌体组均大于对照组,差异均有统计学意义(t=4.697、4.825、3.516、2.706, P值均<0.05)。测量6次后处死裸鼠,剥除肿瘤,外泌体组肿瘤质量(1.62±0.29)g大于对照组(1.00±0.43)g,差异有统计学意义(t=2.929, P<0.05)。肺组织切片HE染色结果显示,两组裸鼠均发生肺转移,外泌体组肺组织转移灶数量为6.63(3,17)个,多于对照组的1.17(0,3)个,差异有统计学意义(W=36.000, P<0.01)。

这个研究表明CAFs来源的外泌体可增加骨肉瘤细胞株Saos-2的迁移及侵袭能力,同时促进骨肉瘤的生长和肺转移的形成。(生物谷Bioon.com)

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