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多篇研究揭示Prickle1基因调节额骨成骨细胞分化

  1. Osterix
  2. Prickle1
  3. RUNX2
  4. 成骨细胞
  5. 碱性磷酸酶
  6. 膜内骨化
  7. 软骨内骨化
  8. 颅底
  9. 颅骨穹窿
  10. 额骨

来源:本站原创 2019-01-28 21:53

2019年1月28日/生物谷BIOON/---由于颅骨原基(skull primordia, 发育中的头骨)中成骨细胞(osteoblast)的迁移和分化缺陷,囟门(fontanelle)增大和前额骨(frontal bone)变小可导致颅骨遭受机械损伤。Wnt/PCP信号通路通常在胚胎发育期间调节组织中的细胞迁移和运动。在近期的一项研究中,美国匹兹堡大学牙医学院颅面再生中心的Yong Wan及其
2019年1月28日/生物谷BIOON/---由于颅骨原基(skull primordia, 发育中的头骨)中成骨细胞(osteoblast)的迁移和分化缺陷,囟门(fontanelle)增大和前额骨(frontal bone)变小可导致颅骨遭受机械损伤。Wnt/PCP信号通路通常在胚胎发育期间调节组织中的细胞迁移和运动。在近期的一项研究中,美国匹兹堡大学牙医学院颅面再生中心的Yong Wan及其同事们着重研究了Prickle1基因,即颅骨中Wnt/PCP信号通路的一个核心组分。

在这项研究中,Wan等人使用了Prickle1的错义等位基因,即Prickle1Beetlejuice(PrickleBJ)。纯合的PrickleBJ/BJ 'Beetlejuice'突变小鼠(也称为小鼠突变体,突变型小鼠)是小头畸形的,并且在未充分发育的额骨之间形成增大的囟门,不过顶骨(parietal bone)是正常的。这些纯合突变小鼠具有其他几种颅面缺陷,包括中线唇裂,不完全渗透性腭裂和头部近端-远端生长减少。他们在这些纯合突变小鼠的额骨凝聚区中观察到下降的Wnt/β-catenin和Hedgehog信号转导。相关研究结果已发表在Scientific Reports期刊上。
图片来自Scientific Reports, doi:10.1038/s41598-018-36742-0。

在这些纯合突变小鼠中,额骨成骨细胞前体细胞(osteoblast precursor)经历了延迟分化和下降的迁移标志物表达,从而导致额骨发育不全。Wan等人发现Prickle1蛋白功能有助于骨形成细胞(即成骨细胞前体细胞)的迁移和分化,并且在这种突变动物模型中,它的缺失会导致缺陷。纯合突变小鼠(PrickleBJ/BJ)出现心脏流出道错位和腭裂,从而导致突变小鼠的围产期死亡。因此,这些表型特征是从胚胎早期阶段到胚胎晚期阶段观察到的。

从本质上讲,颅面复合体(craniofacial complex)包含三个不同的区域:颅骨穹窿(skull vault)、颅底(cranial base)和面部。颅底骨骼通过软骨内骨化(endochondral ossification)形成,而颅骨穹窿中的骨生成通过膜内骨化(intramembranous ossification)发生。颅骨穹窿和颅底都是胚胎起源的(起源自神经嵴或中胚层)。

在这种研究模型中,Beetlejuice突变小鼠(Bj)的Prickle1基因含有点突变(C161F),Bj C161F突变对细胞质蛋白Prickle1的功能有害。人体内这种蛋白发生的突变通常与家族性癫痫有关。这种突变体表型与Prickle1的另一个独立点突变(C251X)一致,包括肢体发育不良和腭裂。尽管这个基因的蛋白产物在细胞质中广泛表达,但是人们对它在颅面骨生成中的作用知之甚少。

在这项研究中,Wan等人使用阿尔新蓝(alcian blue)和茜素红(alizarin red)组织学染料分析头部的骨骼和软骨。这种纯合突变小鼠的头骨较小,而且头部的近端-远端长度随着颅骨侧方宽度的增加而减小。这些结果表明在野生型小鼠(Prickle+/+)中,鼻骨(nasal bone)对颅骨穹窿总长度的贡献在统计学上显著减少。

相反,在纯合突变小鼠(PrickleBJ/BJ)中,额骨对头部总近端-远端长度的贡献增加了,而顶骨作出的贡献比例保持不变。总之,这些结果表明额骨发育的各个阶段都需要Prickle1蛋白功能。

Wan等人通过研究这种蛋白在野生型小鼠胚胎和突变小鼠胚胎中的组织分布,着重关注Prickle1在发育中的颅骨穹窿中的功能。他们发现Prickle1突变导致额骨发育过程中的两个过程存在缺陷,包括延迟的成骨细胞分化和它们在额骨中的迁移减少。在锁骨颅骨发育不良(cleidocranial dysplasia, CCD)的表型谱中,也观察到这些额骨缺损。

这种观察到的额骨功能不全可能是由于增殖缺陷和细胞死亡造成的。Wan等人使用苏木精和伊红(H&E)组织学染料进行了研究,并通过观察野生型小鼠与突变型小鼠在胚胎阶段第12.5周(embryonic stage 12.5, E12.5)时的额骨凝聚区来测试这个假设,这是因为额骨凝聚区通常会在E12.5时形成。此后,他们进行了TUNEL凋亡测定,测定结果表明在不论是野生型还是突变型,存在着非常少的凋亡细胞。

这项研究包括对突变小鼠与野生型小鼠进行BrdU标记细胞计数,计数结果显示增殖细胞所占的比例也没有差异。随后利用磷酸-组蛋白H3免疫组织化学方法对活跃分裂细胞的数量进行测试,结果表明在同窝出生的小鼠中,分裂细胞的数量不存在差异。鉴于细胞死亡和增殖没有变化,Wan等人接下来决定测试成骨分化(osteogenic differentiation)是否正确发生。

为此,Wan等人进行了RNA原位杂交实验,以评估额骨中的前成骨细胞(pre-osteoblast)和成骨细胞内的碱性磷酸酶(ALP)和Osterix(OSX,也称为Sp7)表达。他们检测到RUNX2和ALP的表达,其中RUNX2是额骨中成骨细胞定向分化的早期标志物,ALP是更成熟的成骨细胞的标志物。到胚胎阶段第15.5周(E15.5)时,与野生型同窝出生小鼠相比,突变小鼠额骨外颅层中的Runx2、ALP和OSX表达下降了。他们确定额骨中延迟的膜内骨化(间充质组织转化为骨)会导致发育不良的Beetlejuice突变体。

Wan等人通过研究小鼠突变体中经典Wnt和Hedgehog信号转导的水平,进一步确定存在缺陷的信号转导系统是否导致延迟的额骨骨生成。这些结果表明颅骨发育所需的Hedgehog信号转导的水平确实在突变小鼠中是有缺陷的。

最后,他们在野生型和突变型同窝出生小鼠中进行了成骨细胞迁移标志物的原位杂交(标志物为Engrailed1、Twist1、Msx1和Msx2)实验。在突变小鼠额骨原基中的标志物表达水平下降了。这些结果表明在颅骨穹窿发育的各个阶段,Prickle1蛋白功能是介导成骨细胞前体细胞迁移所必需的。

通过这种方式,Wan等人分析了作为了解小头畸形病因的一种新模型的Beetlejuice突变小鼠。目前用于确定小头畸形中面部和颅骨生长模式的动物模型的数量是有限的。他们在研究中将与Prickle1突变体相关的遗传、分子和物理机制结合在一起,发现这些Prickle1突变体导致这种新小鼠模型中的颅面部区域生长下降。

他们将继续开展研究以便了解细胞迁移和每个区室(脑部、颅骨穹窿和颅底)的改变如何导致小头畸形、颅骨模式化和生长。(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

1.Yong Wan et al. Prickle1 regulates differentiation of frontal bone osteoblasts, Scientific Reports (2018). DOI: 10.1038/s41598-018-36742-0

2.Osteogenesis: The Development of Bones

3.Shiqin Zhang et al. Dose-Dependent Effects ofRunx2on Bone Development, Journal of Bone and Mineral Research (2009). DOI: 10.1359/jbmr.090502

4.Angel Pan et al. A review of hedgehog signaling in cranial bone development, Frontiers in Physiology (2013). DOI: 10.3389/fphys.2013.00061

5.S Mundlos et al. Mutations Involving the Transcription Factor CBFA1 Cause Cleidocranial Dysplasia, Cell (2004). DOI: 10.1016/S0092-8674(00)80260-3


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