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逆转TGF-β免疫抑制作用的CART

来源:德泉兴业 2018-08-02 14:12

 

 

以往的CART都是识别结合表达于肿瘤细胞表面的抗原,此次整理分享的文章,作者设计了识别可溶性抗原的CART细胞,并对CART激活过程中CAR在结构层面的变化进行了研究,具体内容如下:

可溶性的CD19能激活CD19 CART细胞(CD69表达上调、细胞因子生成增多)

电泳发现CD19以单体和二聚两种形式存在,再结合前人研究成果,文章作者推测二聚形式的配体可能对受体激活有某种意义

为了验证二聚化配体对于CART激活的作用,文章作者设计了GFPCAR系统,并制备了单体GFP和二聚GFP两种配体

只有二聚化GFP配体能激活CART细胞,暗示配体可能调节受体二聚化

电泳结果显示CAR在未激活状态下以单体和二聚两种形式存在,说明受体自身二聚化并不足以激活产生信号

基于上面的实验结果,作者又设计了两个GFP CAR,分别识别不同的GFP表位,推测单体形式的GFP通过两个表位可以把CAR“拉”到一起 - 配体调节受体二聚化

只表达识别单一表位CAR的细胞无法被单体EGFP激活,但当两种CAR同时表达于细胞后,EGFP即可激活细胞,暗示配体通过调节受体二聚化激活细胞

以钙流为指标看信号激活,显微镜观察发现信号的激活不依赖细胞接触 - 可溶性配体可激活CART细胞

上面达到可溶性配体通过诱导受体二聚化可激活CART细胞,怎么应用这个呢?TGF-β是存在与实体瘤微环境中的免疫抑制分子,如果能设计一个识别结合它的CART,利用TGF-β激活CART细胞岂不就逆转了其免疫抑制作用,文章作者从三个TGF-β单抗中“拆出”scFv段,3个scFv均能阻断TGF-β信号

选取阻断信号能力最强的scFv段设计CAR

TGF-β无法在表达TGF-βCAR的细胞上激活其信号(磷酸化SMAD2),反而激活了CART细胞的NFAT和NFkB信号

TGF-β无法在发挥免疫抑制作用,反而促进TGF-βCART细胞激活、产生细胞因子

TGF-β功能被逆转:促进TGF-βCART细胞扩增

TGF-β以同源二聚形式存在,那么它识别结合CAR必然存在以上三种模式:1、把两个细胞“拉”到了一起,2、把同一个细胞两个CAR“拉”到了一起,3、1和2同时存在。这三种模式激活信号对于细胞浓度依赖性不同

用NFAT-EGFP报告系统验证,发现高细胞密度利于CART细胞激活,低密度下CART细胞亦可激活(d:无需细胞间互作)

研究CART细胞被激活后CAR的空间分布:激活后CAR会聚簇

激活后CAR会聚簇与ZAP70共定位(ZAP70定位于膜附近,是TCR的一部分,对于T细胞信号传递起重要作用),暗示CAR聚簇对于细胞激活意义重大

研究影响CAR聚簇的因素:突变胞外连接scFV段和跨膜区肽段中能形成二硫键的半胱氨酸并不影响CAR聚簇

研究影响CAR聚簇的因素:胞内区突变也不影响聚簇,用抑制剂抑制微丝则影响CAR的聚簇,暗示是CAR的聚簇是微丝依赖的

到这里作者发现:1、配体调节受体二聚化,2、受体在缺失配体的情况下二聚化不足以激活信号,3、配体结合受体后受体空间分布发生变化且与信号传递关键蛋白共定位!文章作者推测CAR信号的传递是一种力传导 - 配体与受体结合后引起受体二聚化对受体有个拉力,这个拉力使得位于胞内的信号段伸向胞浆,利于胞内信号段域各种下游分子接触、传递信号

既然是力传导,对于传递力、连接scFv和胞内区的那个“绳子”长短肯定有一定影响,作者设计了两个“绳子”长度不同的CAR,发现长度并不影响CAR的表达水平

以GFP报告系统看“绳子”长度对于TGF-βCART激活的影响:短“绳”更利于力的传导,CART细胞的激活

以细胞因子生成看“绳子”长度对于TGF-βCART激活的影响:短“绳”更利于力的传导,细胞因子的生成

文章作者以不同的视角、巧妙的设计了逆转TGF-β免疫抑制作用的CART!在可溶性抗原这个体系里研究配体(抗原)与受体(CAR)的互作,发现了抗原诱导CAR二聚化、聚簇,通过力传导信号!更进一步发现胞外连接scFV“绳子”长短对于信号传递的意义 - 让我们对CAR的认识变得更加细腻!

Chang ZeNan L,Lorenzini Michael H,Chen Ximin et al. Rewiring T-cellresponses to soluble factors with chimeric antigen receptors.[J] .Nat. Chem. Biol., 2018, 14(3): 317-324.(生物谷Bioon.com)

 

 


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