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黄志伟课题组在《自然》发表论文揭示 Anti-CRISPR 蛋白抑制 SpyCas9 活性的分子机制。

  1. Anti-CRISPR
  2. 蛋白抑制

来源:哈尔滨工业大学/王计 2017-05-02 09:53

4 月 28 日,哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组在《自然》(《Nature》)在线发表了题目为《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子机制》(Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an an
4 月 28 日,哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组在《自然》(《Nature》)在线发表了题目为《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子机制》(Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein)的研究论文。

CRISPR-Cas 系统是细菌编码的用来保护细菌免受噬菌体感染的适应性免疫系统,该系统通过 crRNA 引导的 Cas 核酸酶剪切入侵病毒的 DNA 或者 RNA 从而防御病毒感染。由于 CRISPR-Cas 系统与 sgRNA 组合具备高效、便捷“编辑”目的 DNA 的能力,CRISPR II- A 亚型系统之一的链球菌 Cas9(SpyCas9)系统已被广泛应用于全世界范围内的生物医学研究以及基因治疗领域,进行细胞、组织或个体内 DNA 的敲除、激活、修饰、突变等,而且该系统已经成为目前最重要的、也是最广泛使用的基因编辑工具。

但是,如何减少 SpyCas9 过度激活或者长时间活性带来的基因编辑脱靶效应,以及如何对 SpyCas9 的活性进行时间、空间或条件性的精确控制,是当下 SpyCas9 系统用于细胞或组织基因编辑、基因治疗等亟需解决的重要并具挑战性的科学问题。早先的研究发现一类来自于 Listeria monocytogenes 前噬菌体的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在细胞内能够抑制 SpyCas9 的基因编辑活性,然而这些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子机制并不清楚。

为了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能够直接结合 SpyCas9,课题组首先建立体外生物化学研究系统,研究发现 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接结合 SpyCas9-sgRNA 复合物,有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和结合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用,而和单独 SpyCas9 并没有相互作用;进一步实验发现 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能够直接抑制 SpyCas9 介导的目的 DNA 的剪切。

为了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子机制,课题组纯化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物,并通过结构生物学研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物的晶体结构,该复合物结构揭示 AcrIIA4 蛋白构象是一个新的折叠,它结合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三个结构域形成的凹槽区域。该凹槽区域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的结合位点;另外来自 AcrIIA4 的β1 折叠片前的 Loop 与 RuvC 活性位点接触也加强了 AcrIIA4 对 SpyCas9 的抑制作用。上述结构观察结果显示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 竞争性结合 SpyCas9,AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更强的亲和力的实验结果进一步支持了结构观察的结果。接下来的生化实验结果进一步证实 AcrIIA4 结合 SpyCas9 后抑制底物 PAM DNA 结合 SpyCas9,从而拮抗 SpyCas9 的活性。

非常显着的是,AcrIIA4 的酸性氨基酸 Asp14、Asp37、Glu40、Asp69 和 Glu70 的位置完全与结合 SpyCas9 的底物 PAM DNA 的磷酸主链位置一致,而且上述 AcrIIA4 的氨基酸直接和 SpyCas9 PI 结构域上的 PAM DNA 识别氨基酸 Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335 和 Arg1333 互作。这些结构观察结果揭示 AcrIIA4 通过模拟 PAM DNA 结合 SpyCas9。SpyCas9 蛋白的 AcrIIA4 结合氨基酸在同亚型 N. meningitidis Cas9 (NmeCas9) 中保守,而在不同亚型 II-C Listeria monocytogenes Cas9 (LmoCas9) 中并不保守,从而很好地解释了 AcrIIA4 为什么能抑制 LmoCas9 的活性,却不能抑制 NmeCas9 的活性。

课题组通过进一步结构比较、分析发现,单独 SpyCas9 上并不存在 AcrIIA4 的结合位点,SpyCas9-sgRNA 复合物的形成,使得 SpyCas9 构象发生显着变化,组装形成 AcrIIA4 结合位点,从而很好地解释了本项目初始生化研究结果显示的 AcrIIA4 只结合 SpyCas9-sgRNA 复合物,而不结合单独 SpyCas9。该结果也和细菌细胞内单独 SpyCas9 是瞬时存在的,而 SpyCas9-sgRNA 复合物是主要存在形式相一致。SpyCas9-sgRNA 复合物形成时,也是噬菌体被细菌 CRISPR 免疫系统“发现”并将被“干扰”之时,因此,这个阶段(SpyCas9-sgRNA 复合物期)是噬菌体抑制细菌的适应性免疫系统(CRISPR-Cas9)的最合适时期。

该研究揭示的 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA4 抑制 SpyCas9 活性的分子机制,不仅对揭示细菌免疫系统(CRISPR-Cas9)与噬菌体防御系统(Anti-CRISPR)“军备竞赛”的共进化分子机制具有重要的科学意义,而且为设计时间、空间特异性地,或条件性地精确控制 SpyCas9 基因编辑活性的工具提供了结构基础。该成果是黄志伟团队继 CRISPR-Cpf1(Nature,2016;RNA Biology,2017)、CRISPR-C2c1(Cell Research,2017) 等研究成果之后,在病原与宿主相互作用和基因编辑分子机制研究领域取得的又一重要研究成果。

黄志伟教授为本研究论文的通讯作者,该团队的博士研究生董德、郭明慧和硕士研究生王思涵 3 位同学为该论文的并列第一作者。该团队的师资博士后朱玉威、硕士生王硕、熊智、杨建增、本科生徐增亮参与部分研究工作。全部研究工作在哈工大完成。上海同步辐射中心为晶体数据收集提供了支持。本项目受到国家自然科学基金委、哈工大青年科学家工作室等基金的资助。(生物谷 Bioon.com)



原文出处;

De Dong et al.Structural basis of CRISPR–SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein,Nature (2017).DOI:10.1038/nature22377

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