DC细胞培养SOP
来源:ThermoFisher 2015-11-16 17:44
一、脐血MNC分离:1、将脐血袋剪开,分装在50ml离心管中,每管20ml。2、离心1500rpm,10min。3、取出上层血浆,送质检部检测病毒和支原体。4、取出分界处附近细胞,用D-hanks重悬,比例为1:1。5、在50ml离心管中加
一、脐血MNC分离:
1、将脐血袋剪开,分装在50ml离心管中,每管20ml。
2、离心1500rpm,10min。
3、取出上层血浆,送质检部检测病毒和支原体。
4、取出分界处附近细胞,用D-hanks重悬,比例为1:1。
5、在50ml离心管中加入20ml Ficoll淋巴细胞分离液,将上述细胞悬液加到Ficoll分离液上方,分离液与细胞悬液比例为2:3。
6、离心2000rpm,25min,20℃,升速slow,降速off。
7、用移液管吸去上层血浆,小心取出分界处白膜层细胞,分到两个50ml离心管中,每管加D-hanks 40ml重悬。
8、离心400g,8min,4℃,升降速调到最大。
9、吸去上清,细胞沉淀加适量D-hanks重悬。
10、离心400g,8min,4℃,升降速调到最大。
11、吸去上清,细胞沉淀加适量D-hanks重悬。
12、离心400g,8min,4℃,升降速调到最大。
13、吸去上清,细胞沉淀用含1% FBS的RPMI-1640培养基重悬,计数后调整细胞浓度为4*106/ml,接种到T175培养瓶中,置孵箱中孵育2h。
二、DC培养:
1、2h后取出培养瓶,镜下观察有细胞贴壁,吸去悬浮的细胞,并加入少量培养基冲洗瓶底两次,将洗液与悬浮细胞混合,计数后离心后用于培养CIK细胞。
2、根据贴壁细胞数(接种细胞总数减去悬浮细胞数),沿瓶口缓慢加入DC无血清培养基,细胞浓度1*106/ml,并添细胞因子DC-5(0.1μl/ml)和DC-6(0.1μl/ml)。
3、第三天加半量培养基,并补充细胞因子DC-5(0.1μl/ml)和DC-6(0.1μl/ml)。
4、第五天进行促熟,加入肿瘤裂解液10-100μg/ml ,孵育24h。
5、第六天加入DC-A(0.5μl/ml),DC-B(1μl/ml),DC-C(1μl/ml),DC-D(1μl/ml),孵育24h。
6、第七天收获的成熟DC细胞,将细胞从培养瓶中吸取到50ml离心管中,并加入D-hanks冲洗瓶底两次,收集细胞。
7、将细胞离心,400g,8min,4℃,升降速调到最大。
8、吸去上清,细胞沉淀加适量D-hanks重悬。
9、离心,400g,8min,4℃,升降速调到最大。
10、吸去上清,细胞沉淀加含10% FBS和CIK-2'(1μl/ml)的RPMI-1640完全培养基重悬到40ml,加入到CIK细胞培养体系中。
三、肿瘤组织消化
1、将手术后取得肿瘤组织于D-hanks中浸泡,清洗表面血污。
2、将肿瘤组织浸于75%酒精中,超声10s。
3、将肿瘤组织浸于含500U/mL双抗的D-hanks中2h。
4、取出肿瘤组织,用D-hanks冲洗后剪碎,放到蓝盖瓶中,加入1倍体积以上的胶原酶NB4(0.2%)和DNase I(5U/mL)消化1-2h。
5、将消化液过滤粗漏,并用适量 D-hanks冲洗滤渣。
6、消化液离心1500rpm,15min。
7、吸去上清,沉淀加适量 D-hanks重悬,过滤300目滤网。
8、离心1500rpm,10min,重复两次。
9、细胞沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,计数,按1*106/mL的浓度接种到培养瓶中。
10、第二天观察细胞贴壁情况并换液,根据生长情况传代。
四、肿瘤细胞裂解
1、将培养的肿瘤细胞用胰酶消化后,用D-hanks悬浮,浓度为5*106 /ml,加到冻存管中,每管1mL。
2、将冻存管浸于液氮中冰冻(5~10mim)后于37℃水浴使融化,反复冻融5次。
3、冻融后离心300g,10min,收取上清。
4、蛋白裂解液经0.22μm滤膜过滤,测蛋白浓度,冻于-80℃待用。
版权声明 本网站所有注明“来源:生物谷”或“来源:bioon”的文字、图片和音视频资料,版权均属于生物谷网站所有。非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,否则将追究法律责任。取得书面授权转载时,须注明“来源:生物谷”。其它来源的文章系转载文章,本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,转载内容不代表本站立场。不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。