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一个条件性细胞剔除模式小鼠的诞生

来源:生物谷 2013-02-25 10:50


(图片来源于网络)

对于基因敲除(gene knockout)小鼠大家并不陌生,比如想要研究一个基因在体内的功能,我们可以将这个基因从小鼠体内敲除掉。有时候除了关心一个基因的功能外,我们还想知道表达该基因的细胞在体内的作用。比如,我们想知道B细胞是干什么的,胰岛细胞是干什么的?我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉(也叫细胞剔除,cell depletion),一看不能产生新抗体了,或是胰岛素没了,血糖升高器官衰竭了,我们就可以恍然大悟说:“你看,胰岛细胞是产生胰岛素的,B细胞是产生抗体的”。然后就可以发文章到CNS(Cell, Nature, Science)了。当然这些都被别人发现过了,是我们没有赶上好时代。

那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢?方法有,却不多。这里我讲一个非常简单的方法,就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素(Diphtheria toxin, 简称DT)大家可能知道,很多小孩子得过白喉blabla。DT这东西通过跟细胞表面的白喉毒素受体(DT receptor,简称DTR)蛋白结合,之后毒素被带进细胞内,它通过特定机制把细胞废掉。不过,这种DTR只在灵长类(比如人,猴等)有,小鼠等啮齿类动物没有。换言之,即使一大堆DT注射到小鼠体内,小鼠也依然安然无恙。所以就有聪明人想,可以让小鼠某些细胞表达DTR,然后给小鼠注射一针DT就可以把这种有DTR的细胞干掉,也就是我题目讲的细胞剔除。如果在给DTR加一个标签(EGFP),这样还可以看看到底哪个细胞绿了(EGFP),再给小鼠肚子上来一针DT,piapia,绿细胞不见了。多神奇!这种方法最早是被用来剔除树突状细胞(dendritic cells, 简称DC)(2002年)。Jung等将DTR-EGFP这个融合蛋白放在DC细胞特异分子CD11c启动子控制之下,做了一个转基因小鼠。注射一针DT之后,DC真的不见了。该研究成果发表在Immunity杂志上。这样后来人就用它来研究DC细胞在体内功能了,后来这个DTR-EGFP融合蛋白基因又被用来剔除巨噬细胞(CD11b)(Duffield JS),Lgr5肿瘤干细胞(如果真有的话)(Tian H, et al)和调节性T细胞(FoxP3)(Rudensky A. et al.)。关于这个剔除调节性T细胞,想当年我也做了这个FoxP3-DTR-EGFP,做出来比Rudensky实验室还早呢,但是愣是被他们先发了,从此也奠定了我彻底离开学术界的不归路。

为了使这个DTR用途更广,有人把它放在了Rosa26启动子下(Buch T, et al.),即Rosa-iDTR小鼠。其实是在Rosa26启动子跟DTR之间放了一个loxP-STOP-loxP(Rosa26-loxP-STOP-loxP-DTR)。正常情况下,这个小鼠里没有细胞表达DTR,因为在Rosa26启动子和DTR之间有一个大大的“STOP”,Rosa26启动子“够不到”DTR。可是当这个小鼠跟Cre小鼠结婚生子之后,小鼠仔们哪个细胞有Cre,哪个细胞就会有DTR,因为Cre这把剪刀把“STOP”移走了,这样Rosa26启动子就够到了DTR(Rosa26-loxP-DTR)。这个时候再给小鼠DT,DT杀哪个细胞就完全看Cre在哪个细胞了。

个人是学免疫的。尽管有人可能不同意,我自个儿还是觉得免疫学的核心问题是一种叫“免疫记忆”的东西。比如天花,人接种之后一辈子也不再得了。而有些疫苗接种之后几个月就不保护了;更有甚者,有些家伙根本引不起免疫记忆,当然也不可能用它来做疫苗了。尽管免疫学研究已经有上百年的历史了,但直到现在我们对于免疫记忆的起始、维持和消亡的分子机制也很不了解。如果了解了免疫记忆的机制,就可以更好地设计疫苗,增强人民体质,进而保家卫国。我在读博士的时候就对这个大课题特别感兴趣,然后做博士后开始研究模式动物,觉得可以对免疫记忆做些研究了,当然最后我不成功。当时还没有rosa-iDTR(这个小鼠没有EGFP)的时候,我想如果做一个Rosa-iDTR-EGFP小鼠,然后做无数的Cre小鼠,这样我就可以把细胞一群一群的杀死,就可以知道哪些细胞对免疫记忆有帮助。举个例子:假如说表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关系,那我可以做一个IL6-Cre小鼠,然后跟Rosa-iDTR-EGFP小鼠交配。得到的小鼠先用病毒感染一次,这个时候只要是曾经表达过IL-6的细胞都是绿色的,并且都带有了DTR。这样我可以把EGFP阳性的细胞分离出来,转到另一只小鼠里,看是不是可以把免疫记忆带过去?或是在第二次病毒感染之前,先给小鼠来一针DT,这样只要是曾经表达过IL-6的细胞就都被干掉了,然后再看是不是把免疫记忆也顺带给干掉了。如果结果真是这样,至少可以说明表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关,咱再往下研究就是了。哇塞,那个时候我发财了,至少发一篇超过15分的文章有可能吧。当然恰好是IL-6的可能性不是很大。但我可以把所有的细胞因子全做成cre小鼠呀,是不是成功的可能性就大起来了呢?很可惜我的博士后生涯结束了,做一个小公司,也可以把这个做出来!

公司一旦能够开始做基因敲除小鼠了,我就想终于可以开始把这个模型做出来了。下面就是设计思考怎么做了。通过我自己的经验和发表的文章,这个DTR-EGFP融合蛋白信号特别弱。如果比较一下CD11c-EYFP跟CD11c-DTR-EGFP; 或是FoxP3-EGFP和FoxP3-DTR-EGFP,信号强度简直是一个天上一个地下。说明这个DTR和EGFP互相处不好。我就想对这个做一个改造,把DTR-EGFP融合蛋白做成DTR-2A-EGFP,这样这俩哥们一起被表达出来,但表达完就分开了,互不干扰。这个时候就可以把DTR-2A-EGFP放在rosa26位置了。且慢,还不行。因为Rosa26启动子太弱了,即使是用EYFP单基因,阳性跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里,谁知道是不是能够看到EGFP信号呀。所以我们想可以放一个强启动子,于是我们选择了pCAG启动子,这家伙不但动力强劲,而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就开始做一个叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP(简称pCAG-iDTR-EGFP吧)的工具鼠。 我得意呀,觉得可以找一批人做免疫记忆了。但我们的投资人给了我当头棒喝,说不能把公司做成研究所。做公司了还老想着科研,简直就是婚姻里找小三儿,必须坚决悔改,主要是改。也就是做公司必须以盈利为目的。我绝望了一阵,然后想,既然不让我自己做,我也可以给别人呀。他们发文章,然后说老鼠是我们这里来的,说不定谁还把我名字挂在他们文章里,也挺美的呀。

2012年9月这个小鼠出来了,先把种群扩起来,从一个到几十个。然后就想得到的小鼠跟我预期的是不是一回事儿?于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因(CD19)的cre小鼠交配,年前得到了一只CD19-Cre/pCAG-iDTRGFP小鼠。因为只有珍贵的一只,所以先采血看看是不是有GFP信号。答案是有,还不错(Fig 1a)。至少是目前为止看到的DTR-EGFP中信号最好的。下面就是要看DT是不是可以把这群EGFP细胞给杀死。只有一只小鼠,也没有对照,咱也不能直接一针进去,还没有个重复。所以我们就把这个小鼠的脾脏个取出来,然后把它的所有细胞洗吧洗吧再转到另外几只小鼠之中,这个时候再注射DT。24小时后,采点血看看见分晓了。没有注射DT的小鼠,EGFP阳性细胞还在;注射DT的小鼠呢,EGFP阳性细胞不见了(Fig 1b)。说明这个小鼠是成功的。

那这个工具鼠怎么用呢?海了去了。我列几个我自己感兴趣的。

比如我想研究I型糖尿病,我就可以把这个小鼠跟胰岛细胞特异的Cre小鼠交配,然后所有胰岛细胞都是绿的。注射DT就可以让beta细胞仙去,这个小鼠都没有胰岛素了,就得了糖尿病,当然这个是非常干净的I型糖尿病模型。刚出的973项目有个课题是研究I型糖尿病引起的继发性器官衰竭机制和干预的,这是一个多好的模型呀。比用STZ诱导干净多了。 当然我们是公司,没有资格申请这种高水平的国家大课题。现在细胞治疗很火。如果想做胰岛细胞移植治疗,研究者最担心的就是受体鼠本身beta细胞去不干净,还会再生。你把自己用ES/iPS好不容易分化出来的beta细胞打进去,检测胰岛素,不知道是自己打进去的beta细胞产生的呢,还是受体小鼠自身当初没有杀干净的beta细胞产生的。多影响情绪呀。如果用我们这个小鼠,你把自己的细胞漂红,小鼠的细胞是绿的,直接就可以用眼看。最不济还可以不断注射DT,让小鼠自己没有产生新胰岛细胞的机会。如果把这个小鼠跟NSG小鼠交配,说不定就可以直接研究从人iPS来的beta细胞的功能应用了,这是不是可以更快地上临床呢?

还有人想研究肝脏再生机制的。可以把这个小鼠跟albumin-cre小鼠交配,让所有肝细胞都变绿带DTR。再通过不同剂量的DT来杀死肝细胞,研究肝损伤多好呀。如果是NSG背景,不用做手术就可以做人鼠嵌合肝移植了。对药物研究多有贡献呀。

这个用途很广,想杀谁杀谁,完全看你不喜欢哪个细胞。管你是神经、癌症、心脏、肺脏的。当然还有我最欣赏的免疫细胞。如果有人想做免疫记忆的话,这个工具鼠就是真正找到了归宿。

现在种群不是很大,只有几十只,先给老客户,然后给不是客户的客户。我相信今后会有成百上千的文章是用这个小鼠做出来的。(生物谷Bioon.com)

本文先发表于个人新浪博客,略有改动。
原文链接:
http://blog.sina.com.cn/s/blog_a82125c301016p0u.htmlbb

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