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Nat Biotech:研究开发出高通量基因组编辑新技术

来源:《自然-生物技术》 2012-04-11 11:22

近日,国际著名杂志《自然—生物技术》Nature Biotechnology刊登了来自美国麻省总医院研究人员的最新研究成果“FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing,”,文章中,研究者开发了一项新技术,利用这一技术他们可以快速生成大量的转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases ,TALENs),从而大大提高了研究人员敲除研究基因或改变它们表达的能力。

TALENs是一种可靶向特异DNA序列的酶,由于具有一些比锌指核酸酶(ZFNs)更优越的特点,现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。

“新技术实现了高通量生成TALENs,这将有可能完全改变大量生物学研究的方式,让所有的研究人员都能快速简便地靶向敲除任何的目的基因,”文章的共同资深作者、麻省总医院病理系研究副主任J. Keith Joung博士说。

TALENs是借助于TAL效应子,一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对的。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割,从而导入新的遗传物质。相比于ZFNs,TALENs可以靶向更长的基因序列,并且相对更容易于构建。但是直到现在研究人员也没有找到廉价、可供公众使用的快速生成大量TALENs的技术。

在新文章中,Joung和同事开发了一种称为FLASH(快速连接自动化固相高通量,fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput)的系统,该系统可在磁珠上装配编码TALEN的DNA片段,借助于外部磁铁将磁珠保持在原位,通过液体处理机器实现自动化构建DNA,在一天内可构建编码多达96种TALENs的DNA序列,每个TALEN的成本约为75美元。此外,Joung还开发了一种手动的FLASH使得实验室无需借助机器设备即可在一天构建24种TALEN序列。在人类细胞中测试这一系统,研究人员发现FLASH装配TALENs能够成功诱导已知参与癌症或表观遗传学调控的96个靶基因中的84个基因断裂。

文章的共同资深作者、Joung 实验室研究人员Jeffry D. Sander 博士说:“我们发现85-90%的FLASH装配TALENs在人类细胞中具有高度基因组编辑活性,表明我们能够基本上靶向任何的目标DNA序列,其能力大大超越了其他的核酸酶。这种能够生成靶向所有DNA序列的TALEN的能力将很有可能改变我们对于基因改造技术的思维方式,因为现在问题不再是你能否靶向你的目的基因,而是你希望靶向和改变哪些基因。”

研究小组还发现TALEN序列越长,对于细胞产生毒副效应的可能性就越小。他们猜测有可能是因为越短的TALENs越有可能结合和改变非目标基因位点。Joung指出这表明了设计较长TALENs用于未来研究和潜在治疗应用的重要性。

2008年,Joung和其他研究机构的同事建立了锌指协会(Zinc Finger Consortium,http://zincfingers.org),旨在生成可广泛应用于研究实验室的ZFNs遗传工程技术。现在他的研究小组正在探索构建学术团体可获得的、FLASH构建TALENs所需的信息和材料,当前可通过http://TALengineering.org获取这些工具的信息。基因组编辑核酸酶(Gene editing nucleases),包括ZFNs 和 TALENs,在2011年被《自然—方法学》(Nature Methods)评为了“年度实验室技术”。

Joung说:“尽管我相信TALENs易于设计,具有更好的靶向范围将使其成为优于ZFNs的选择,但ZFNs较小的尺寸和它们氨基酸序列较少重复的特性也将使它们在某些应用中具有优势。就当下而言,最重要的就是继续开发这两项技术。”(生物谷Bioon.com)

FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing

Deepak Reyon,1, 2, 3, 4 Shengdar Q Tsai,1, 3, 4 Cyd Khayter,1 Jennifer A Foden,1 Jeffry D Sander1, 3 & J Keith Joung1, 3

Engineered transcription activator–like effector nucleases (TALENs) have shown promise as facile and broadly applicable genome editing tools. However, no publicly available high-throughput method for constructing TALENs has been published, and large-scale assessments of the success rate and targeting range of the technology remain lacking. Here we describe the fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput (FLASH) system, a rapid and cost-effective method for large-scale assembly of TALENs. We tested 48 FLASH-assembled TALEN pairs in a human cell–based EGFP reporter system and found that all 48 possessed efficient gene-modification activities. We also used FLASH to assemble TALENs for 96 endogenous human genes implicated in cancer and/or epigenetic regulation and found that 84 pairs were able to efficiently introduce targeted alterations. Our results establish the robustness of TALEN technology and demonstrate that FLASH facilitates high-throughput genome editing at a scale not currently possible with other genome modification technologies.

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