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Nat. Methods:ADAR——在神经元中追踪RNA编辑的雷达

来源:生物谷 2011-12-29 13:31

RNA编辑是基因表达中关键的一步。布朗大学的科学家在自然-方法学期刊上报道称,他们设计出了一种基因,能直观地呈现关键性酶ADAR在活体果蝇中的活动。

为了跟踪他们看不到的东西,飞行员需要注视雷达屏幕上的绿光。现在,生物学家也有了一个他们自己的绿光指示器,用于监测基因的表达、个体的差异以及疾病:布朗大学的生物学家开发了一个能跟踪ADAR的"雷达",ADAR是神经系统中RNA编辑的关键酶。

这项技术为科学家开辟了一条道路,使他们能够观察活体动物中ADAR是何时在何地活跃着以及有多少在活跃。正如自然-方法学期刊中描述的,在实验中科学家展示了在果蝇大脑的学习记忆中心内ADAR酶的RNA编辑活动存在惊人的个体差异。

"我们设计了这种报告分子为我们报告来自机体的荧光,"生物学教授Rober Reenan博士说,同时他也是文章的通讯作者。"当涉及到基因的表达和调控时,魔鬼就藏在细节中。"

"生物学家已经知道,在DNA转录RNA这个过程中出现的错误能导致神经系统中基因的异常表达,可能会引起如癫痫、抑郁及精神分裂之类的疾病。最近,他们已经收集到ADAR与疾病相关的证据。例如在2个月前的自然-神经科学期刊报道的一项研究中,Reenan和宾夕法尼亚大学的同事们描述了ADAR和果蝇中脆性X智力低下模型之间的深刻联系。"

Reenan说,使用这种新的"报告"工具来寻找ADAR活动水平与行为或疾病之间的联系,有可能为探究RNA编辑错误是如何导致这种差异提供新的见解。但他同时也推测,他和他的研究小组创造的荧光ADAR跟踪系统的原理,有可能在将来的某一天能被用于开发基于RNA修复的疗法。他们的"报告"工具需要通过ADAR将RNA中一个被精心破坏的碱基固定在一个设计好的基因上来工作。"我们实际上是在核苷酸水平上修复RNA,"Reenan说。"这里,我们已经证明我们能够让一个突变版本的DNA恢复功能,但是是在RNA水平而不是DNA水平。"

Reenan和第三作者Kyle Jay在2006年事开始创造这个报告分子,当时Jay还是一个本科生。他们从一个很有名的分子生物学工具入手--一个水母基因,所产生的蛋白暴露于紫外光时能发出绿色的荧光(即绿色荧光蛋白)。研究的策略就是故意在这个基因中制造一些特别适合ADAR修复的错误。

首先他们精心设计了一个必需"内含子"密码纳入这个基因中,这个"内含子"密码需要一个特定的剪切操作发生。然后他们插入了"终止密码子"T-A-G替代了T-G-G,这将导致转录的停止,有效地防止了绿色荧光蛋白的产生。但在剪切发生前,当ADAR发现RNA转录体中的U-A-G终止密码子时,它会将A修改为I,结果恢复了正确的信息,整个基因的翻译工作正常进行,好像DNA中的那个终止突变并不存在一样。因此,当剪切和ADAR编辑发生时,带有这个基因的神经元便会发出绿光。

为了了解ADAR编辑及剪切发生的部位,与单独的剪切相比,他们也为设计的基因装配了一个剪切组件,但不是TAG密码子。当剪切单独发生时,将会产生黄色的荧光蛋白。

有了新的ADAR报告分子,Reenan和第一作者James Jepson着手在果蝇中做一些生物学观察。其中之一就是在发育期幼虫大脑的特定部位ADAR的活动比成虫大脑相应部位的活动更加显著。该小组还发现在相似年龄的果蝇个体之间,ADAR在大脑中的活动也有很大的差异。这很让人惊讶,Reenan说,因为所有的这些果蝇在遗传上是完全相同的。

一个多功能的新工具?

Reenan说,他很有信心,ADAR报告分子在除果蝇之外的其他生物中也非常有用。创造报告分子的想法诞生于实验室大量物种的比较基因组学研究。ADAR,同时也被发现存在于无脊椎和脊椎动物中。事实上,在文章中,研究者描述测试了他们设计的灵活性,将它们插入设计好的水母基因--蛾的剪切内含子中。

"因此,也即是一个水母-蛾的基因嵌合体被突变损害,然后由一个果蝇的酶来修复",Reenan说,"Rube Goldberg会感到自豪的"。

Reenan说,他计划将ADAR报告分子用于果蝇中继续探索与脆性X相关的基因,同时他也迫切希望从事小鼠功能障碍研究的学者也尝试下这个ADAR报告分子。

将这种方法(即指导ADAR在RNA水平上纠正被错误转录的RNA或反转DNA的损伤)应用于治疗方法可能还太过遥远,但从某种意义上说,至少现在ADAR是在雷达上。

除了Reenan、Jepson和Jay,论文的其他作者还有Yannis A.Sawa。Jepson也隶属于费城托马斯杰弗逊大学,Jay目前在加州大学旧金山分校工作。

一个埃里森医学基金会高级学者奖资助了这项研究。(生物谷bioon.com)

Visualizing adenosine-to-inosine RNA editing in the Drosophila nervous system.

ames E C Jepson, Yiannis A Savva, Kyle A Jay, Robert A Reenan.

Abstract: Informational recoding by adenosine-to-inosine RNA editing diversifies neuronal proteomes by chemically modifying structured mRNAs. However, techniques for analyzing editing activity on substrates in defined neurons in vivo are lacking. Guided by comparative genomics, here we reverse-engineered a fluorescent reporter sensitive to Drosophila melanogaster adenosine deaminase that acts on RNA (dADAR) activity and alterations in dADAR autoregulation. Using this artificial dADAR substrate, we visualized variable patterns of RNA-editing activity in the Drosophila nervous system between individuals. Our results demonstrate the feasibility of structurally mimicking ADAR substrates as a method to regulate protein expression and, potentially, therapeutically repair mutant mRNAs. Our data suggest variable RNA editing as a credible molecular mechanism for mediating individual-to-individual variation in neuronal physiology and behavior.

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