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第一节 自身抗体的免疫组织化学检测方法

来源:www.bioon.com 2007-08-08 21:58

第一节 自身抗体的免疫组织化学检测方法

  1.常规检查法-间接免疫荧光检查方法

  (1)取大白鼠的肝、肾、心、小白鼠胃,人甲状腺,横纹肌等单独或制成复合冰冻切片(4~5μm,)。其中1片用56℃甲醇固定3min,另切一片不固定,分别放入湿盒中。

  (2)将病人血清用0.01mol/l Ph7.2~7.4磷酸缓冲盐水(PBS)作1:5稀释,滴加覆盖抗原切征,置湿盒中,37℃,30~60min。

  (3)切片用PBS洗2次,每次5min。用电磁搅拌或振荡帮助洗净不参与反应的血清蛋白。吹干。

  (4)滴加抗人IgG或γ-球蛋白荧光抗体(用0.01%伊文氏蓝稀释)覆盖切片,37中放置30min。

  (5)用PBS洗2次,方法同步骤(3),随后,再用蒸馏水洗1min。

  (6)缓冲甘油(pH9.0~9.5,PBS或碳酸盐缓冲液1份和1份甘油混合)封片。

  2.对照试验可作空白,替代,一步法抑制或吸收等对照,以证明阳性结果的特异性。

  3.荧光显微镜检查阳性荧光呈明亮的黄绿色荧光,抗原组织成分呈现出阳性荧光时,即证明病人有对该组织成分的自身抗体,如细胞核呈明亮的黄绿色荧光即报告抗核抗体阳性。对阳性结果根据需要可进一步作滴度检查。

  近来一些报告认为用培养细胞作某些自身抗体检查,可以取得良好的效果。

  在检查自身抗体中常常可出现某种非特异性荧光,如粘液腺分泌物,粘液细胞,白细胞,胃粘膜表现的食物残渣,心肌异嗜性抗体反应等,以及有时用大白鼠胃组织切片出现的壁细胞非特异荧光等,容易引起混淆。这些问题都可通过对照试验(包括用正常人血清)和观察者的经验加以排除。

  4.结果报告  根据荧光显微镜观察的结果一是形态特征,二是荧光的亮度。在报告时先报告阳性荧光的形态名称加抗体如抗核抗体,再描述荧光亮度,主要靠观察者的主观目测,可分阴性和阳性两种结果,阳性又可分“+”为可见较弱的荧光,“++”为明亮的荧光,“+++”为耀眼的荧光。虽然这样的目测记录精确度可能在不同观察者之间有差别,但经过训练和有较多的观察经验后,这种方法基本上是可靠的,也便于推广应用。

  近年使用荧光显微分光光度计和图像分析仪等定量检测方法,结果比较客观,将结果打印报告更适合于临床诊断和科学研究,应争取采用这些先进仪器和方法,改进结果的判断,记录和报告。

  5.免疫酶组织化学检测自身抗体方法免疫酶组织化学间接法可以代替免疫荧光法用于自身抗体的检测,但尚未普遍采用。其优点是可以用普通显微镜观察结果,更适合于基层实验室使用,标本也可长期保存。

  (1)抗原(与免疫荧光法相同)。

  (2)操作方法:

  ①抗原切片先用0.01mol/L pH7.4PBS洗1次,吹干,放入湿盒中。

  ②滴加1:5稀释的待检血清,37,30min。

  ③PBS洗2次,每次5min,吹干。

  ④滴加适当稀释的酶标记A蛋白或抗人IgG抗血清,37,30min。

  ⑤用辣根过氧化物酶底物显色(同前述免疫酶法),室温10min。

  ⑥水洗。

  ⑦0.1%伊文氏蓝或苏木精染色5min。

  ⑧水洗,常规酒精脱水,透明封片。

  结果:阳性为棕色,阴性为蓝色。在第3步之后可用1%H2O2作用15min消除内源酶干扰。

  6.自身抗体的联合检测方法在血清中存在的多种自身抗体,可用多种组织抗原组合制作成复合抗原检测。抗原组成可包括以下组织:

  (1)肝脏:①检出抗核抗体;②抗肝细胞膜抗体;③抗胆管上皮细胞抗体;④抗核仁抗体等。可用大鼠或小鼠肝组织。

  (2)胃:①检出胃壁细胞抗体;②平滑肌抗体;③抗核抗体。必须用小鼠胃组织。

  (3)甲状腺组织:①检出甲状腺球蛋白抗体;②检出甲状腺微粒体抗体;③检出抗第二胶质抗体;④检出抗核抗体。可用人、猴、兔等甲状腺组织。

  (4)肾:①检出线粒体抗体(远端肾小管);②抗核抗体;③抗基底膜抗体。

  (5)心肌:抗心肌抗体。

  (6)横纹肌:①肌无力全并胸腺瘤A带(暗带)抗体;②肌无力I带(明带)抗体和H带抗体;③肌无力白纤维骨骼肌抗体;④肌无力骨骼肌红纤维抗体。

  (7)人结肠;抗结肠粘膜抗体。

  (8)胰腺:胰腺细胞抗体。

  (9)肾上腺:肾上腺皮质细胞抗体。

  (10)神经组织:根据需要将多种抗原组合。

  按间接法进行检测,如发现某种自身抗体,再作滴度测定,这是一种联合筛选试验,十分简便,已作常规应用。

  7.微波增敏快速自身抗体检测方法近年微波技术用于免疫组织化学检测自身抗体方法,取得了良好的效果。微波是一种高频电磁波,经微波辐射引起离子极化,旋转,分子间磨擦,使能量发生转换,产生热能而加快了抗原抗体反应的速度,适用于临床快速检验和诊断。

  (1)抗原切片(同免疫荧光法)。

  (2)微波增敏快速方法

  ①抗原切片先用PBS洗,吹干,放入湿盒中(用有机玻璃制作,内放少许蒸馏水)。

  ②滴加1:5稀释的待检血清,将湿盒移入微波炉内转盘上,调中档微波强度辐射1min,放置5min。

  ③PBS洗2次,各1min。

  ④荧光抗体反应1min(同步骤2),放5min 。

  ⑤PBS洗2次,各1min。

  ⑥缓冲甘油封片。荧光显微镜检测。

  (3)结果:阳性为黄绿色荧光,阳性为红色。微波炉型号不同,应经预实验选定强度和时间。

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