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第五篇 实验技术--第二十一章 寄生虫学实验技术--第一节 寄生虫学实验诊断技术

来源:www.bioon.com 2007-08-08 12:21

第五篇 实验技术

第二十一章 寄生虫学实验技术

第一节 寄生虫学实验诊断技术

  一、病原检查

  (一)粪便检查

  粪便检查是诊断寄生虫病常用的方法。要取得准确的结果,粪便必须新鲜,送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠内原虫滋养体,最好立即检查。盛粪便的容器要干净,并防止污染与干燥;粪便不可混杂尿液等,以免影响检查结果。

  1.直接涂片法 用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便,连续作3次涂片,可提高检出率。

  ⑴蠕虫卵检查:滴一滴生理盐水于洁净的载玻片,用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块,在生理盐水中涂抹均匀;涂片的厚度以透过涂片约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查,如用高倍镜观察,需加盖片。应注意虫卵与粪便中异物的鉴别。虫卵都具有一定形状和大小;卵壳表面光滑整齐,具固有色泽;卵内含卵细胞或幼虫。

  ⑵原虫检查:

  1)活滋养体检查:涂片应较薄,方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温,滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。

  2)包囊的碘液染色检查:直接涂片方法同上,以一滴碘液代替生理盐水。如碘液过多,可用吸水纸从盖片边缘吸去过多的液体。若同时需检查活滋养体,可在用生理盐水涂匀的粪滴附近滴一滴碘液,取少许粪便在碘液中涂匀,再盖上盖片(图21-1)。涂片染色的一半查包囊;末染色的一半查活滋养体。

图21-1 原虫包囊碘液染色操作方法

  碘液配方:碘化钾4g,碘2g,蒸馏水100ml。

  3)隐孢子虫卵囊染色检查:目前较佳的方法为金胺酚改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存(4℃1个月内)的含卵囊粪便都可用此法染色。染色过程是先用金胺-酚染色,再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下:

  金胺-酚染色法:

  ①染液配制:1g/L金胺-酚染色液(第一液):金胺0.1g,石碳酸5.0g,蒸馏水100ml;3%盐酸酒精(第二液):盐酸3ml,95%酒精100ml;5g/L高锰酸钾液(第三液):高锰酸钾0.5g,蒸馏水100ml。

  ②染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,10~15分钟后水洗;滴加第二液,1分钟后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置荧光显微镜检查。

  低倍荧光镜下,可见卵囊为一圆形小亮点,发现乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色,卵囊壁为一薄层,多数卵囊周围深染,中央淡染,似环状,或深染结构偏位,有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒,应注意鉴别。

  改良抗酸染色法:

  ①染液配制:石炭酸复红染色液(第一液):碱性复红4g,  95%酒精20ml,石炭酸8ml,蒸馏水100ml;10%硫酸溶液(第二液):纯硫酸10ml,蒸馏水90ml(边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中;20g/L孔雀绿液(第三液):20g/L孔雀绿原液1ml,蒸馏水10ml。

  ②染色步骤:滴加第一液于粪膜上,1.5~10分钟后水洗;滴加第二液,1~10分钟后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置显微镜下观察。

  经染色后,卵囊为玫瑰红色,子孢子呈月牙形,共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色,容易与卵囊区分。

  不具备荧光镜的实验室,亦可用上述方法先后染色,然后在光镜低、高倍下过筛检查,发现小红点再用油镜观察。效果好,可提高检出速度和准确性。

  2.厚涂片透明法(改良加藤法)取约5mg(已用100目不锈钢筛除去粪渣)粪便,置于载玻片上,覆以浸透甘油-孔雀绿溶液的玻璃纸片,轻压,使粪便铺开(20×25mm)。置于30~36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干,即可镜检。

  玻璃纸准备:将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片,浸于甘油-孔雀绿溶液(含纯甘油100ml、水100ml和3%孔雀绿1ml的水溶液)中,至少浸泡24小时,至玻璃纸呈现绿色。

  使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间。如粪膜厚,透明时间短,虫卵难以发现;如透明时间过长,则虫卵变形,也不易辨认。

  3.浓聚法

  ⑴沉淀法:原虫包囊和蠕虫卵的比重大可沉集于水底,有助于提高检出率。但比重较小的钩虫卵和某些原虫包囊则效果较差。

  1)重力沉淀法:取粪便20~30g、加水成混悬液,经金属筛(40~60孔)或2、3层湿纱布过滤,再加清水冲洗残渣;过滤粪液在容器中静置25分钟,倒去上液,重新加满清水,以后每隔15~20分钟换水一次(3~4次),直至上液清晰为止。最后倒去上液,取沉渣作涂片镜检。如检查包囊,换水间隔时间宜延长至约6小时换一次(图21-2)。

图21-2 粪便沉淀及毛蚴孵化法

  2)离心沉淀法:将上述滤去粗渣的粪液离心(1500~2000rpm/min)1~2分钟,倒去上液,注入清水,再离心沉淀,如此反复沉淀3~4次,直至上液澄清为止,最后倒去上液,取沉渣镜检。

  3)汞碘醛离心(MIFC)沉淀法:粪便1g,加适量(约10ml)汞碘醛液,充分调匀,用2层脱脂纱布过滤,再加入乙醚4ml,摇2分钟,离心(2000rpm/min)1~2分钟,即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物4层。吸弃上面3层,取沉渣镜检。

  汞碘醛配制:

  ①汞醛(MF)液:1/1000硫柳汞酊200ml,甲醛(40%)25ml,甘油50ml,蒸馏水200ml。
②卢戈氏液:碘5g,碘化钾10g,蒸馏水100ml。

  检查时取汞醛液2.35ml及5%卢戈氏液0.15ml混合备用。但混合液在8小时后即变质,不应再用;碘液亦不这且于1周后再用。

  4)醛醚沉淀法:置粪便1~2g于小容器内,加水10~20ml调匀,将粪便混悬液经2层纱布(或100目金属筛网)过滤,离心(2000rpm/min)2分钟;倒去上层粪液,保留沉渣,加水10ml混匀,离心2分钟;倒去上液,加10%甲醛7ml。5分钟后加乙醚3ml,塞紧管口并充分摇匀,取下管口塞,离心2分钟,即可见管内自下而上分为4层。取管底沉渣涂片镜检。如检查原虫包囊,可加卢戈氏液染色,加盖片镜检。

  ⑵浮聚法:利用比重较大的液体,使原虫包囊或蠕虫卵上浮,集中于液体表面。常用的方法有两种:

  1)饱和盐水浮聚法:此法用以检查钩虫卵效果最好。用竹签取黄豆粒大小的粪便置于浮聚瓶(高3.5cm,直径约2cm的圆形直筒瓶)中,加入少量饱和盐水调匀,再慢慢加入饱和盐水到液面略高于瓶口,但不溢出为止。此时在瓶口覆盖一载玻片,静置15分钟后,将载玻片提起并迅速翻转,镜检(图21-3)。

图21-3 饱和盐水浮聚法

  饱和盐水配制:将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内,不断搅动,直至食盐不再溶解为止。

  2)硫酸锌离心浮聚法:此法可用于检查原虫包囊,球虫卵囊和蠕虫卵。取粪便约1g,加10~15倍的水,充分搅碎,按离心沉淀法过滤,反复离心3~4次,至水清为止,最后倒去上液,在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液(33%的溶液),调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm处,离心1分钟。用金属环取表面的粪液置于载玻片上,加碘液一滴,镜检。

  3)蔗糖离心浮聚法:此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约5g,加水15~20ml,以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液离心5~10分钟,吸弃上清液,加蔗糖溶液(蔗糖500g,蒸馏水320ml,石炭酸6.5ml)再离心,然后如同饱和盐水浮聚法,取其表液膜镜检(高倍或油镜)。卵囊透明无色,囊壁光滑,内有一小暗点和发出淡黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大,常紧贴于盖片之下,但1小时后卵囊脱水变形不易辨认,故应立即镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖溶液。

  常见蠕虫卵、包囊的比重如表21-1。

表21-1 蠕虫卵及包囊的比重

虫卵或包囊 比 重 华支睾吸虫卵 1.170~1.190 姜片吸虫卵 1.190 肝片形吸虫卵 1.200 日本血吸虫卵 1.200 带绦虫卵 1.140 微小膜壳绦虫卵 1.050 钩虫卵 1.055~1.080 鞭虫卵 1.150 蛲虫卵 1.105~1.115 受精蛔虫卵 1.110~1.130 未受精蛔虫卵 1.210~1.230 毛圆线虫卵 1.115~1.130 溶组织内阿米巴包囊 1.060~1.070 结肠内阿米巴包囊 1.070 微小内蜒阿米巴包囊 1.065~1.070 蓝氏贾第鞭毛虫包囊 1.040~1.060

  4.毛蚴孵化法 依据血吸虫卵内的毛蚴在适宜温度的清水中,短时间内可孵出的特性而设计的方法,适用于星期血吸虫病患者的粪便检查。取粪便约30g,先经重力沉淀法浓集处理,将粪便沉渣倒入三角烧瓶内,加清水(城市中需用去氯水)至瓶口,在20~30℃的条件下经4~6小时后肉眼或放大镜观察结果。如见水面下有白色点状物作直线来往游动,即是毛蚴。必要时也可用吸管将毛蚴吸出镜检。如无毛蚴,每隔4~6小时(24小时内)观察一次。气温高时,毛蚴可在短时间内孵出,因此在夏季要用1.2%食盐水或冰水冲洗粪便,最后一次才改用室温清水(图21-2)。

  毛蚴促孵法:将沉淀法处理后的粪便沉渣置于三角瓶内,不加水,或将粪渣置于吸水纸上,再放在20~30℃温箱中过液。检查时,加清水,2小时后就可见到孵出的毛蚴。此法毛蚴孵出时间较一致,数量也较多。

  5.肛门拭子检查法 适用于在肛周产卵(蛲虫),或常在肛门附近发现虫卵(带绦虫)的虫卵检查法。

  ⑴棉签拭子法:先将棉签浸泡在生理盐水中,取出时挤去过多的盐水,在肛门周围擦拭,随后将棉签放入盛有饱和盐水的试管中,用力搅动,迅速提起棉签,在试管内壁挤干盐水后充去,再加饱和盐水至管口处,覆盖一载玻片,务使其接触液面,5分钟后取载玻片镜检。也可将擦拭肛周的棉签放在盛清水的试管中,经充分浸泡,取出,在试管内壁挤去水分后弃去。试管静置10分钟,或经离心后,倒去上液,取沉渣镜检。

  ⑵透明胶纸法:用长约6cm,宽约2cm的透明胶纸粘擦肛门周围的皮肤,取下胶纸,将有胶面平贴玻片上,镜检。

  6.试管滤纸培养法 也称钩蚴培养法。根据钩虫卵在适宜条件下可在短时间内孵出幼虫的原理设计的方法。如冷开水约1ml于洁净试管内(1×10cm),将滤纸剪成与试管等宽但较试管稍长的T字型纸条,用铅笔书写受检者姓名或编号于横条部分。取粪便约0.2~0.4g,均匀地涂抹在紧竖条纸条的上部2/3处,再将纸条插入试管,下端浸泡在水中,以粪便不接触水面为度。在20~30℃条件下培养。培养期间每天沿管壁补充冷开水,以保持水面位置。3天后肉眼或放大镜检查试管底部。钩蚴在水中常作蛇形游动,虫体透明。如未发现钩蚴,应继续培养观察至第5天。气温太低时可将培养管放入温水(30℃左右)中数分钟后,再行检查(图21-4)。

图21-4 钩蚴培养法

  此法亦可用于分离人体肠道内各种阿米巴滋养体及人毛滴虫滋养体,且能提高检出率。但是,每管粪便量应为1.0g;适宜温度为25~30℃;培养时间为2~4天。临床上为了及时报告致病原虫,可于培养48小时后镜检。检查肠道各种原虫,仍应结合碘液涂片法以检出原虫包囊。

  7.虫卵计数法 虫卵计数用于估计人体内寄生虫的感染度,常用司徒尔(Stoll)氏法,即司氏稀释虫卵计数法(图21-5)。

图21-5  司氏虫卵计数法

图21-6  定量板

  用特制的三角烧瓶(或普通三角烧瓶),容量为65ml左右,在烧瓶的颈部相当于56和60ml处有两个刻度。先把0.1mol/l NaOH溶液倒入瓶内至56ml处,再慢慢地加入粪便,到液面上升到60ml处,然后放进玻璃珠10余颗,用橡胶塞塞紧瓶口,充分摇动,使其成为十分均匀的混悬液。

  计数时充分摇匀,用有刻度的小吸管取0.075或0.15ml粪液置于载玻片上,加盖片,在低倍镜下计算全片的虫卵数。乘以200(吸0.075ml)或100(吸0.15ml)即得每克为粪便虫卵数。由于粪便的性状明显地影响估算结果,因此不成形的粪便的虫卵数应再乘粪便性状系数,即半成形粪便×1.5,软湿形粪便×2,粥状粪便×3,水泻形粪便×4。

每克粪便含卵数×24小时粪便克数 
雌虫数= 已知雌虫每天排卵总数

成虫总数=雌虫总数×2

  8.定量透明法 适用于各种粪便内蠕虫卵的检查及计数。此法系应用改良聚苯乙烯作定量板(图21-6),大小为40×30×1.37mm,模孔为一长圆孔,大小为8×4mm,两端呈半圆形,所取的粪样平均为41.7mg。操作时将大小约4×4cm的100目尼龙网或金属筛网覆盖在粪便标本上,自筛网上用刮片刮取粪便,置定量板于载玻片上,用一手的两指压住定量板的两端,将刮片上的粪便填满模孔,刮去多余粪便。掀起定量板,载玻片上留下一个长形粪样,然后在粪条上覆盖含甘油-孔雀绿溶液的大小约为5.0~2.6cm的玻璃纸条,展平后加压,使玻璃纸下的粪便铺成长椭圆形。经1~2小时粪便透明后置镜下计数。将所得虫卵数×24,再乘上述粪便性状系数,即为每克粪便虫卵数(eggs  per gram,EPG)。常见蠕虫的每条雌虫每天排卵数如表21-2。

表21-2 各种蠕虫每条雌虫每日排卵数

虫 名 产卵数/日/条(平均数) 华支睾吸虫 1600~4000(2400) 姜片虫 15000~48000(25000) 卫氏并殖吸虫 10000~20000 日本血吸虫 1000~3500 猪带绦虫 30000~50000/孕节 牛带绦虫 97000~124000/孕节 十二指肠钩虫 10000~30000(24000) 美洲钩虫 5000~10000(9000) 蛔虫 234000~245000(240000) 鞭虫 1000~7000(2000)

  9.淘虫检查法 为考核驱虫疗效,常需从粪便中淘取蠕虫进行鉴定与计数。取患者服药后24~72小时的全部粪便,加水搅拌,用筛(40目)或纱布滤出粪渣,经水反复冲洗后,倒在盛有清水的大型玻皿内。检查混杂在粪渣中的虫体时,应在玻皿下衬以黑纸。

  10.带绦虫孕节检查法 绦虫节片用清水洗净,置于两载玻片之间,轻轻压平,对光观察内部结构,并根据子宫分支情况鉴定虫种。也可用注射器从孕节后端正中部插入子宫内徐徐注射炭素墨汁或卡红,待子宫分支显现后计数。

  卡红染液配制:钾明矾饱和液100ml,卡红3g,冰醛酸10ml。混合液置于37℃温箱内过夜,过滤后即可应用。

  (二)血液检查

  血液检查是诊断疟疾、丝虫病的基本方法。涂制血膜用的载玻片用前需经洗涤液处理,自来水、蒸馏水冲洗,在95%酒精中浸泡,擦干或烤干后使用。

  洗涤液配制:常用玻璃器皿的洗涤液为铬酸洗液,含工业浓硫酸100ml,重铬酸钾80g,水1000ml。先用冷水将重铬酸钾溶化,然后徐徐加入浓硫酸,同时用玻璃棒搅拌。

  1.检查疟原虫

  ⑴取血与涂片:用75%酒精棉球消毒耳垂,待干后用左手拇指与食指捏着耳垂下方,并使耳垂下侧方皮肤绷紧,右手持取血针、刺破皮肤,挤出血滴。薄、厚血膜可涂制在同一张玻片上(图21-7)。

图21-7 薄厚血膜制作步骤

  1)薄血膜制片:在载玻片1/3与2/3交界处蘸血一小滴,以一端缘光滑的载片为推片,将推片的一端置于血滴之前,待血液沿推片端缘扩散后,自右向左推成薄血膜。操作时两载片间的角度为30~45℃,推动速度适宜。理想的薄血膜,应是一层均匀分布的血细胞,血细胞间无空隙且涂血膜末端呈扫帚状。

  2)厚血膜制片:载玻片的另一端(右)1/3处蘸血一小滴(约10mm³),以推片的一角,将血滴自内向外作螺旋形摊开,使之成为直径约0.8~1cm,厚薄均匀的厚血膜。厚血膜为多层血细胞的重叠,约等于20倍薄血膜的厚度。

  ⑵固定与染色:血片必须充分晾干,否则染色时容易脱落。固定时用小玻棒蘸甲醇或无水酒精在薄血膜上轻轻抹过。如薄、厚血膜在同一玻片上,须注意切勿将固定液带到厚血膜上,因厚血膜固定之前必须先进行溶血。可用滴管滴水于厚血膜上,待血膜呈灰白色时,将水倒去,晾干。在稀释各种染液和冲洗血膜时,如用缓冲液则染色效果更佳。缓冲液的配制如下:

  磷酸氢二钠液:磷酸氢二钠(Na2HPO4)无水0.464g或Na2HPO4· 2H2O 11.867g或Na2HPO4 · 7H2O17.872g或Na2HPO4· 2H2O23.877g,蒸馏水1000ml。

  M/15磷酸二氢钾液:磷酸二氢钾(Na2HPO4)9.073g,蒸馏水1000ml。

  使用时将上述原液按下页表配成不同的pH缓冲液:

pH M/15KH2PO4(ml) M/15Na2HPO4(ml) 蒸馏水(ml) 6.8 4.9 5.1 90 7.0 6.3 3.7 90 7.2 7.3 2.7 90

  染色时临时配成pH7.0或7.2的缓冲液。

  常用的染色剂有姬氏染剂(Giemsa's stain)、瑞氏染剂(Wright's  stain)。

  1)Giemsa染色法:此法染色效果良好,血膜褪色较慢,保存时间较久,但染色需时较长。

  染液配制:姬氏染剂粉1g,甲醇50ml,纯甘油50ml。将姬氏染粉置于研钵中(最好用玛瑙研钵),加小量甘油充分研磨,加甘油再磨,直至50ml甘油加完为止,倒入棕色玻瓶中。然后分几次用少量甲醇冲洗钵中的甘油染粉,倒入玻瓶,直至50ml甲醇用完为止,塞紧瓶塞,充分摇匀,置65℃温箱内24小时或室温内一周过滤。

  染色方法:用pH7.0~7.2的缓冲液,将姬氏液稀释;比例约为15~20份缓冲液加1份姬氏染液。用蜡笔划出染色范围,将稀释的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上,染色半小时(室温),再用上述缓冲液冲洗。血片晾干后镜检。

  2)快速姬色染色法:姬氏染液1ml,加缓冲液5ml,如前法染色5分钟后用缓冲液冲洗,晾干后镜检。

  3)Wright染色法:此法操作简便,适用于临床诊断,但甲醇蒸发甚快,掌握不当时易在血片上发生染液沉淀,并较易褪色,保存时间不长。多用于临时性检验。

  染液配制:瑞氏染剂粉0.1~0.5g,甲醇97ml,甘油3ml。将瑞氏染剂加入甘油中充分研磨,然后加入少量甲醇,研磨后倒入瓶内,再分几次用甲醇冲洗研钵中的甘油溶液,倒入瓶内,直至用完为止,摇匀,24小时后过滤待用。一般1、2周后再过滤。

  染色方法:瑞氏染液含甲醇,薄血膜不需先固定;而厚血膜则需先经溶血,待血膜干后才能染色。染色前先将溶过血的厚血膜和薄血膜一起用蜡笔划好染色范围,以防滴加染液时四溢。滴染液使覆盖全部厚、薄血膜上,30秒至1分钟后用滴管加等量的蒸馏水,轻轻摇动载玻片,使蒸馏水和染液混合均匀,此时出现一层灿铜色浮膜(染色),3~5分钟后用水缓慢地从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直对血膜冲洗),晾干后镜检。

  2.检查微丝蚴

  ⑴新鲜血片检查:晚间9时至次晨2时取血1滴滴于载玻片上,加盖片,在低倍镜下观察,发现蛇形游动的幼虫后,仍须作染色检查,以确定虫种。

  ⑵厚血膜检查:厚血膜的制作、溶血、固定与姬氏液染色同疟原虫。但需取血3滴,也可用Delafieid苏木素染色法染色。该染液的配制方法如下:

  苏木素1g溶于纯酒精或95%酒精10ml中,加饱和硫酸铝铵(8%~10%)100ml,倒入棕色瓶中,瓶口用两层纱布扎紧,在阳光下氧化2~4周,过滤,加甘油25ml和甲醇25ml,用时稀释10倍左右。

  已溶血、固定的厚血膜在德氏苏木素液内染10~15分钟,在1%酸酒精中分色1~2分钟,蒸馏水洗涤1~5分钟,至血膜呈蓝色,再用1%伊红染色0.5~1分钟,以水洗涤2~5分钟,晾干后镜检。

  ⑶活微丝蚴浓集法:在离心管内装蒸馏水半管,加血液10~12滴,再加生理盐水混匀,离心沉淀3分钟,取沉渣检查。或取静脉血1ml,置于盛有3.8%枸橼酸钠0.1ml的试管中,摇匀,加水9ml,俟红细胞溶化后,离心(3000rpm/min)2分钟,倒去上液,加水再离心,取沉渣镜检。

  (三)排泄物与分泌物等的检查

  1.痰液 痰中可能查见肺吸虫卵、溶组织内阿米巴滋养体、棘球蚴的原头蚴、粪类圆线虫幼虫、蛔蚴、钩蚴、尘螨等;卡氏肺孢子虫的包囊也可出现于痰中,但检出率很低。

  ⑴肺吸虫卵检查:可先用直接涂片法检查,如为阴性,改用浓集法集卵,以提高检出率。

  直接涂片法:在洁净载玻片上先加1~2滴生理盐水,挑取痰液少许,最好选带铁锈色的痰,涂成痰膜,加盖片镜检。如未发现肺吸虫卵,但见有夏科-雷登晶体,提示可能是肺吸虫患者,多次涂片检查为阴性者,可改用浓集法。

  浓集法:收集24小时痰液,置于玻璃杯中,加入等量10%NaOH溶液,用玻棒搅匀后,放入37℃温箱内,数后痰液消化成稀液状。分装于数个离心管内,以1500rpm/min离心5~10分钟,充去上清液,取沉渣滴涂片检查。

  ⑵溶组织内阿米巴大滋养体检查:取新鲜痰液作涂片。天冷时应注意镜台载玻片保温。高倍镜观察。如为阿米巴滋养体,可见其伸出伪足并作定向运动。

  ⑶上述其他的蠕虫幼虫及螨类等宜用浓集法检查。

  2.十二指肠液和胆汁 用十二指肠引流管抽取十二指肠液及胆汁,以直接涂片法镜检;也可经离心浓集后,吸取沉渣镜检。可检查蓝氏贾第鞭毛虫滋养体、华支睾吸虫卵、肝片形吸血卵和布氏姜片虫卵等;急性阿米巴肝脓肿患者偶在胆汁中发现大滋养体。

  检查方法:可将各部分十二指肠引流液滴于载玻片上,加盖片后直接镜检。为提高寄生虫检出率,常将各部分引流加生理盐水稀释搅抖后,分装离心管,以2000rpm/min,离心5~10分钟,吸取沉渣涂片镜检。如引流液过于粘稠,应先加10%NaOH消化后再离心。引流中的贾第虫滋养体常附着在粘液小块上,或虫体聚集成絮片状物。肝片形吸虫卵与姜片虫卵不易鉴别,但前者可出现于胆汁;而后者只见于十二指肠液中。

  3.尿 一般先离心,后取沉渣镜检。但乳糜尿需加等量乙醚,用力振荡,使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪层,离心,取沉渣镜检。

  4.鞘膜积液 主要检查班氏微丝蚴。阴囊皮肤经碘酒精消毒后,用注射器抽取鞘膜积液作直接涂片检查,也可加适量生理盐水稀释离心,取沉渣镜检。

  5.阴道分泌物 检查阴道毛滴虫。

  直接涂片法:用消毒棉签在受检查者阴道后穹窿、子宫颈及阴道壁上取分泌物,然后在有1~2滴生理盐水的载玻片上作涂片镜检,可发现活动的虫体。天气寒冷时,应注意保温。

  悬滴法:取阴道分泌物置于周缘涂抹一薄层凡士林盖片上的生理盐水中,翻转盖片小心覆盖在具凹孔的载玻片上,稍加压使两片粘合,液滴悬于盖片下面,镜检。

  (四)其它器官组织检查

  1.骨髓穿刺 主要检查杜氏利什曼原虫无鞭毛体。一般常作髂骨穿刺,患者侧卧,露出髂骨部位。视年龄大小,选用17~20号带有针芯的干燥无菌穿刺针,从髂骨前上刺后约1cm处刺入皮下,当针尖触及骨面时,再慢慢地钻入骨内约0.5~1.0cm,即可拔出针芯,接上2ml的干燥注射器,抽取骨髓液。取少许骨髓液作涂片;甲醇固定,同薄血膜染色法染色,油镜检。

  2.淋巴结穿刺

  ⑴利什曼原虫:检出率低于骨髓穿刺,但方法简便、安全,且患者经治疗后,淋巴结内原虫消失较慢,故仍有一定价值。一般选腹股沟部,先将局部皮肤消毒,用左手拇指和食指捏住一个较大的淋结,右手取干燥无菌的6号针头刺入淋巴结,此时淋巴结组织液自能进入针内。稍待片刻,拔出针头,将针头内少量的淋巴结组织液注于载玻片上,作涂片染色检查。也可用摘除的淋巴结的切面做涂片,染色后镜检。

  ⑵丝虫成虫:可用注射器从可疑的淋巴结节中抽取成虫,或剖检摘除的结节寻找成虫,也可作病理组织切片检查。

  3.肌肉活检

  ⑴旋毛虫幼虫:用外科手术从患者的腓肠肌或肱或股二头肌取米粒大小的肌肉一块,置于载玻片上,加50%甘油滴,盖上另一载玻片,均匀用力压紧,低倍镜下观察。取下肌肉须立即检查,否则幼虫变得模糊,不易检查。

  ⑵猪囊尾蚴:摘取肌肉内的结节,剥除外层纤维被膜,在2张载玻片间压平、镜检。也可经组织固定后作切片染色检查。

  4.皮肤 检查疥螨,蠕形螨,利什曼原虫等。

  ⑴疥螨:参看“疥螨和疥疮”!一节。
 ⑵蠕形螨:参看“蠕形螨和蠕形螨病”一节。
 ⑶利什曼原虫:在皮肤上出现丘疹和结节等疑似皮肤型黑热病患者,可选择皮损较明显之处,作局部消毒,用干燥灭菌的注射器,刺破皮损处,抽取组织液作涂片;或用消毒的锋利小剪,从皮损表面剪取一小片皮肤组织,以切面作涂片;也可用无菌解剖刀切一小口,刮取皮肤组织作涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未见原虫,可割取小丘疹或结节,固定后,作组织切片染色检查。

  5.直肠粘膜 用直肠镜从直肠粘膜病变组织内可查见日本血吸虫卵及溶组织阿米巴滋养体。

  日本血吸虫卵:用直肠镜自直肠取米粒大小的粘膜一块,经水洗后,放在2载玻片间,轻轻压平,镜检。虫卵鉴别见表21。-3。

表21-3 粘膜内血吸虫卵未染色之鉴别

活卵 近期变性卵 死卵(钙化卵) 颜色 淡黄至黄褐色 灰白至略黄色 灰褐色至棕红 卵壳 较薄 薄或不均匀 厚而不均匀 胚膜 清楚 清楚 不清楚 内含物 卵黄细胞或胚团或毛蚴 浅灰色或黑色小点或折光均匀的颗粒或萎缩的毛蚴 两极可有密集的黑点含网状结构或块状物

  溶组织阿米巴:用乙状结肠镜观察溃疡形状,自溃疡边缘或深层刮取溃疡组织,置于载玻片上,加少量生理盐水,盖上盖片,轻轻压平,立即镜检。也可取出一小块病变的粘膜组织,固定切片,染色检查。

  6.肺组织 检查卡氏肺孢子虫包囊。取一小块肺组织作涂片,自然干燥后甲醇固定,用改良银染色法进行染色。

  改良银染色法染色步骤:

  1.将肺涂片置于5%铬酸,氧化15分钟,温度为20℃。氧化后的标本均从流水冲洗数秒。
2.1%亚硫酸氢钠经1分钟,自来水冲洗后,蒸馏水洗涤3~4次。
3.放入四胺银工作液内,并在60℃孵育约90分钟,至标本转至黄褐色为止。流水、蒸馏水各洗5分钟。
4.0.1%氯化金2~5分钟,蒸馏水洗4~5次。
5.2%硫代硫酸钠5分钟,流水至少洗10分钟。
6.亮缘复染45秒。
7.95%,99%,100%乙醇逐级脱水。
8.二甲苯透明3次,树胶封片。

  染色结果显示,卡氏肺孢子虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则的多角形,囊壁为淡褐色或深褐色。红细胞为淡黄色,其余背景呈淡绿色。

(陈佩惠 姜洪杰)

  二、免疫论断及新技术应用

  (一)皮内试验

  利用宿主的速发型变态反应,将特异抗原液注入皮内,观测皮丘及红晕反应以判断有无特异抗体(IgE)的存在称皮内试验(intradermal  test,IDT)。

  皮内试验用于多种寄生虫病的检测,如血吸虫病、肺吸虫病等。最常用于血吸虫病的调查,操作简单,并且可即时观察结果,适宜现场应用。大多用粗制可溶性血吸虫虫卵抗原(稀释度为1:4000)或成虫冷浸抗原(稀释度为1:8000)敏感性高,其阳性率在93%~97%,但有部分假阳性反应(2.1%~3.5%),并且对其他寄生虫病交叉反应较高。皮内试验可用作①过筛方法,先作皮试,阳性者再作进一步追查;②临床辅助诊断;③考核预防效果,用作检查新感染的方法,特别对儿童。

  (二)染色试验

  染色试验(dye test,DT)是比较独特的免疫反应,是目前诊断弓形虫病较好的方法,已广泛用于该病的临床诊断和流行病学调查。

  新鲜弓形虫滋养体和正常血清混合,在37℃作用1小时或室温数小时后,大部分弓形虫失去原来的新月形,而变为圆形或椭圆形,用碱性美蓝染色时着色很深。但新鲜弓形虫和免疫血清混合时,虫体仍保持原有形态,用碱性美蓝染色时,着色很浅或不着色。其原因可能是由于弓形虫受到特异体抗体和辅助因子协同作用后,虫体细胞变性,结果虫体对碱性美蓝不易着色。

  材料和试剂以弓形虫速殖子为抗原;采用正常人血清为致活因子。碱性美蓝溶液,取美蓝10g加入95%酒精100ml,制成饱和酒精溶液,过滤后取3ml加pH11,要求临用时新鲜配制。待检血清经56℃30分钟灭活,冰箱保存备用。

  方法将待检血清用生理盐水倍比稀释,每孔0.1ml,加上述稀释的弓形虫速殖子0.1ml,置37℃水浴1小时,加碱性美蓝溶液0.02ml/孔,37℃水浴15分钟,以每孔聚悬液1滴于载玻片上,加盖玻片,高倍显微镜检查,计数100个弓形虫速殖子,统计着色和不着色速殖子比例数。

  结果判定以能使50%弓形虫不着色的血清最高稀释度为该血清染色试验阳性效价。阳性血清稀释度1:8为隐性感染;1:256为活动性感染;1:1024为急性感染。

  (三)环卵沉淀试验

  环卵沉淀试验(circumoval precipitin test,COPT)是以血吸虫整卵为抗原的特异免疫血清学试验,卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合,可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀,在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率。

  1.常规法用载玻片或凹玻片进行,加样本血清后,挑取适量鲜卵或干卵(约100~150个,从感染动物肝分离),覆盖24×24mm盖片,四周用石蜡密封,37℃保温48小时后,低倍镜观察结果,必要时需观察72小时的反应结果。典型的阳性反应为泡状、指状、片状或细长卷曲状的折光性沉淀物,边缘整齐,与卵壳牢固粘连。阴性反应必须观察全片;阳性者观察100个成熟卵,计环沉率及反应强度比例。环沉率是指100个成熟虫卵中出现沉淀物的虫卵数。凡环沉率≥5%者可报告为阳性,(在基本消灭和消灭血吸虫病地区环沉率≥3%者可判为阳性),1%~4%者为弱阳性。环沉率在治疗上具有参考意义。

  2.分级强度判定

  “-”折光淡,与虫卵似连非连;“影状”物(外形不甚规则,低倍镜下有折光,高倍镜下为颗粒状)及出现直径小于10μm的泡状沉淀物者,皆为阴性。

  “+”虫卵外周出现泡状沉淀物(>10μm),累计面积小于虫卵面积的1/2;或呈指状的细长卷曲样沉淀物,不超过虫卵的长径。

  “++”虫卵外周出现泡状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/2;或细长卷曲样沉淀相当或超过虫卵的长径。

  “+++”虫卵外周出现泡状沉淀物的面积大于虫卵本身面积;或细长卷曲样沉淀物相当或超过虫卵长径的2倍。

  3.近年来对COPT的方法作了一些改进如①双面胶纸条法:将双面胶纸条制特定的式样作COPT,可省略蜡封片法的繁琐步骤,具有操作简易,方法规范,提高工效和避免空气污染的优点。双面胶纸条法COPT(DGS-COPT)已在现场扩大应用,今后若能将该法配套干卵,则更能提高它的应用价值;②血吸虫干卵抗原片(或膜片)环卵沉淀试验,利用环卵抗原活性物质的耐热特性,将分离的纯卵超声和热处理,定量滴加,烤干固定于载玻片或预制的聚乙稀薄膜上。此种干卵膜片,保存时间较长(4℃半年),已有市售商品。试验时只需加入血清试样,湿盒孵育,判读结果与常规法相同。干卵膜片法还具有简化操作规程,提高卵抗原的规范要求,并可长期保存等优点。

  COPT可作为诊断血吸虫病的血清学方法之一,及临床治疗病人的依据;可用作考核治疗和防治效果的方法;并且用于血清流行病学调查及监测疫情的方法。

  (四)间接血凝试验

  间接血凝试验(indirect haemagglutination test,IHA)是以红细胞作免疫配体的载体,并以红细胞凝集读数的血清学方法。最常用的红细胞为绵羊或人(O型)红细胞,来源方便。目前均用醛化红细胞,可保存半年而不失其免疫吸附性能。

  操作步骤如下:

  1.红细胞鞣化和致敏 ①取醛化红细胞用0.15mol/L,pH7.2PBS离心洗涤2次,并用PBS配成2.5%悬液;②加等量1:2000鞣酸溶液(鞣酸不同批号,质量相差较大必须预试测定适宜浓度)37℃孵育20分钟,经常摇动;③离心去上清,PBS洗1次,再用0.15mol/L,pH6.4PBS配成10%悬液;④每份悬液加等量适当稀释的抗原液,置于37℃水浴箱中30分钟(每5分钟振动一次),离心去上清,pH7.2PBS洗2次,再用含1%正常兔血清(NRS)10%蔗糖缓冲液配成5%细胞悬液。加1‰叠氮钠防腐,存4℃或减压冻干备用,每批致敏细胞均需用已知阳性和阴性血清滴定灵敏度或特异性。阳性滴度在1:640以上,阴性血清不出现反应者可用。

  2.微量血凝试验 在U型(或V型)微量血凝板上,将被试血清用1%NRS或BSA生理盐水作倍比系列稀释,每孔含稀释血清0.05ml。每孔加0.01ml致敏红细胞悬液(可用标定过的OT针头滴加),充分振荡摇匀,加盖于室温静置1~2小时读取结果。

  3.根据红细胞在孔底的沉积类型而定。“-”,红细胞沉于管底,呈圆点形,外周光滑;“±”,红细胞沉于管底,周围不光滑或中心有白色小点;“+”,红细胞沉积范围很小,呈较明显的环形圈;“++”,红细胞沉积范围较小,其中可出现淡淡的环形圈;“+++”,红细胞布满管底呈毛玻璃状;“++++”,红细胞呈片状凝集或边缘卷曲。呈明显阳性反应(+)的最高稀释度为该血清的滴度或效价。

  目前对血吸虫病应用纯化虫卵抗原间接血凝试验。采用经SephadexG-100柱层析纯化的血吸虫卵抗原致敏红细胞作IHA,提高了方法的敏感性,特异性和重现性,为在疫区扩大应用提供了条件。

  IHA操作简便,敏感性高,适于现场使用,可作为辅助论断病人,流行病学调查及综合查病方法。先后在多种寄生虫感染中应用,如血吸虫,疟疾、猪囊虫,旋毛虫,肺吸虫,阿米巴,弓形虫,肝吸虫等。有些已制成商品诊断药盒。不足之处是不能提供检测抗体的亚型类别,和容易发生异常的非特异凝集。另外抗原的标准化,操作方法规范化急待解决,以提高其诊断效果和可比性。

  (五)免疫荧光法

  免疫荧光法(immunofluorescent method,IF)是借抗原抗体反应进行特异荧光染色的诊断技术。最常用的荧光素为异硫氰基荧光素(fluorescein  isothiocynate,FITC)。常用于寄生虫感染的荧光抗体染色有直接法与间接法。

  1.直接法 用于检测抗原,其缺点是每查一种抗原必须制备与其相应的荧光标记的抗体。目前很少应用。
2.间接法 也称间接荧光抗体法(indirect fluorescent antibody  method,IFA)。将抗原与未标记的特异性抗体(如患者血清)结合,然后使之与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体(抗抗体)结合,三者的复合物可发出荧光。本法的优点是制备一种荧光标记的抗体,可以用于多种抗原,抗体系统的检查,即可用以测定抗原,也可用来测定抗体。IFA的抗原可用虫体或含虫体的组织切片或涂片,经充分干燥后低温长期保存备用。一张载片可等距置放多个抗原位点用以同时检测多个样本或确定滴度。

  IFA的操作步骤如下:①抗原标本:用记号笔或蜡笔将各个抗原位点围圈隔离;②在每个抗原位置滴加已稀释的血清样本或样本稀释系列,使样本液充满圈内,置湿匣37℃孵育30分钟;③用pH8.00.01mol/L PBS冲后再置同样PBS液中浸泡5分钟,不时摇动,如此2遍,然后取出吹干;④在抗原位点滴加经pH8.0PBS适当稀释的羊抗人IgG荧光抗体(每批结合物的工作浓度需经滴定),使完全覆盖抗原膜,置湿盒37℃孵育30分钟;⑤经洗涤(同③)后用0.1‰伊文思蓝液复染10分钟,然后以PBS流水冲洗0.5~1分钟,风干;⑥用pH8.5或pH8.0碳酸(或磷酸)缓冲甘油封片,也可加一小滴PBS(pH8.0)覆以盖片镜检。镜检应及时进行以免疫光衰变。可使用荧光光源或轻便荧光光源,配以适合的激发滤片和吸收滤片,在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发适合的激发滤片和吸收滤片,在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发光体、而阴性对照不可见者为阳性反应。根据荧光亮度及被检物形态轮廓的清晰度把反应强度按5级区别(+++,++,+,±,-)。+以上的荧光强度为阳性。

  该法具有较高的敏感性、特异性和重现性,应用抗原经济。国内外广泛应用于寄生虫病的血清学诊断方法,血清流行病学调查和监测疫情的方法,如主要用于诊断疟疾、丝虫病及血吸虫病,也有用于肺吸虫病、华支睾吸虫病、包虫病及弓形虫病的血清学诊断。

  近10年来,国内学者对IFA进行了很多改进。李允鹤等(1984,1988)通过深入研究,确定了感染鼠肝细胞内虫卵冰冻切片为IFA较为理想的诊断抗原。该法需用荧光显微镜判断结果,限制了它的应用范围。但是应用该法时必须具备的荧光抗体,目前国内已有商品供应,这为IFA的扩大应用,提供了条件。

  (六)对流免疫电泳试验

  对流免疫电泳试验(counter-immunao electrophoretic  assay,CIE)以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速,敏感的电泳技术。

  对流电泳较简单的扩散法和常规免疫电泳法至少敏感10~20倍,省时,省料,可用已知抗原检测抗体或相反,反应结果特异,阳性反应的可信度高,适用范围广。近年来本法的改进已试用酶或放射标记的反应配体,如酶标记抗原对流免疫电泳(ELACIE)、放射对流免疫电泳自显影术(RCIEA)等。以克服电泳技术本身不够灵敏的弱点,国内在血吸虫病、肺吸虫病免疫诊断已获良好结果。国外报道应用于阿米巴病、锥虫病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸虫病等血清学诊断。

  (七)酶联免疫吸附试验

  酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay.ELISA)简称酶联试验,已广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液(血清,脑脊液等)以及排泄分泌物(尿,乳,粪便等)内特异抗体或抗原微粒的检测。根据检测要求,试验可分多种类型,常用者有:用于检测抗体的间接法;检测IgM的双夹心法;检测抗原的双抗体夹心法;以固相抗体检测抗原的竞争法以及竞争抑制法等(图21-8)。

图21-8 酶联免疫吸附试验常用方法示意图

  酶联试验的方法根据所用载体、酶底物系统、观察反应结果等不同而有很大差别。目前最常用的固相载体为聚苯乙稀微量滴定板,具有需样少,敏感,重演性好,使用方便等优点。酶底物系统也有多种,常用的有辣根过氧化物酶-邻苯二胺(HRP-OPD)、碱性磷酸酯酶-硝酚磷酸盐(AKP-PNP)等,具有较好的生物放大效应。其中HRP由于价廉、易得而被广泛应用。

  酶联试验的基本操作过程可分为:①固相包被;②温育洗涤;③加样;④酶结合物反应;⑤底物显色;⑥终止反应读取结果等若干步骤。温育和洗涤需贯穿在每二步骤之间,用以去除多余的反应物。以下为临床上最常用的间接法(检测抗体)和双抗体夹心法(检测抗原)的操作程序:

  ⑴间接法:

  1)以包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.05mol/L,pH9.6)稀释抗原(常用5~10µg/ml),每孔0.1(或0.2)ml包被反应板,37℃湿盒温育2~3小时或4℃过夜;
2)弃去包被液,反应板用去离子水或PBS-Tween液(0.005mol/L PBS含0.05%Tween-20)冲洗3次,甩干;
3)用样本稀释液(0.05mol/L PBS含0.05%Tween-20)稀释样本(起始浓度≥100-1),用样本稀释液(每孔0.1(或0.2)ml,温育1小时;
4)弃去样液,如上冲洗,甩干加稀释结合物(市售品常稀释至100-1,用样本稀释液),每孔0.1(或0.2)ml,温育1~2小时;
5)如上冲洗甩干后即刻加入新鲜配制的底物系统,每孔0.1(或0.2)ml,置暗盒室温15分钟;
6)终止反应:HRP-OPD系统每孔加1mol/LH2SO450µl;
7)目测或用分光光度计在400µm波段测定吸收值来判断。

  ⑵双抗体夹心法:

  1)以包被液稀释抗体(如兔抗血吸虫虫卵可溶性抗原的抗体,抗SEA-IgG)包被反应板(1~1000µg/ml),方法同间接法包被抗原;
2)冲洗,甩干,加样温育同前(起始浓度≥5-1);
3)加结合物(例如抗SEA-IgG-HRP),适宜工作浓度需先经方阵滴定确定;
4)以下各步同间接法。

  若包被抗体与第二抗体来自不同种的供体则可应用市售抗免疫球蛋白结合物。例如包被抗体为羊抗SEA,二抗用兔抗SEA则在未标记的二抗温育洗涤后加羊抗兔IgG结合物(GAP-HRP)。

  [附]酶标记物制备:应用抗原或抗体与酶分子的交联技术,交联物亦称酶结合物(conjugate)。根据酶与抗体(抗原)的激活顺序,交联反应可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的过碘酸钠法多用,戊二醛一步法反应率较低,较适用于交联AKP。免疫球蛋白标记辣根过氧化物酶(过碘酸钠法)与免疫球蛋白标记碱性磷酸脂酶(戊二醛一步法),按常规方法制备。

  抗IgG型抗体酶结合物也可用金黄色葡萄球菌A-蛋白酶结合物替代,称A-蛋白酶联试验(SPA-ELISA)。A-蛋白辣根过氧化物酶结合物(PA-HRP)已有市售标准品,其敏感度稍逊于抗体酶结合物。

  底物配制:不同的酶要求选择相应底物,以下为分别适用于比色和肉眼读取结果的两种HRP常用底物配制。

  邻苯二胺(OPD):经HRP催化后生成橘红色产物。40mgOPD溶于柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)100ml(含24.3ml 0.1mol/L柠檬酸,25.7ml0.02mol/L Na2HPO4加水50ml),临用前加30%H2O20.15ml,温育15分钟后用2mol/l H2SO4终止反应,492nm读数。本底物具高度敏感性,显色梯度良好,生成可溶性产物,有利于比色读数,但为光敏感,反应时应置暗盒内;也具致突变作用。

  5-氨基水杨酸(5AS):经HRP催化生成棕色产物。8mg5AS溶于10ml50℃温热蒸馏水中,置4℃暗处不超过3天,临用前以1n NaOH调pH至6.0,加0.05%H2O2 1ml。37℃经30~60分钟温浴后用1n NaOH终止反应,肉眼或449nm比色。本底物无致突变作用,生成棕褐色不全溶解的产物有利于肉眼判读结果。

  酶联试验为高灵敏检测技术,结果可定量表示,可检测抗体、抗原或特异性免疫复合物,微量滴定板法消耗样本试剂少,能供全自动操作,适用批量样本检测,因此在寄生虫感染的研究和诊断领域乃至血清流行病学均被广泛应用。国内外有多种寄生虫感染的酶联药籍出售,包括有血吸虫病、弓形虫病、阿米巴病、丝虫病、蛔虫病、旋毛虫病和犬蛔虫病等,ELISA可用作辅助诊断病人,血清流行病学调查和监测疫情的方法。酶联试验操作程序的简单快速不如IHA,但方法具有很大所改良潜力和适应范围。判断结果需用分光光度计,限制了扩大应用;另外,应用抗原及酶结合物尚需进一步标准化,操作方法也应规范化。

  近年来已有多种改进的酶联免疫吸附试验如①快速-ELISA:改进特点为用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反应板作载体;将1%可溶性血吸虫卵抗原与尿素溶解性血吸虫卵抗原等量相混合预吸附于薄膜上;用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制备酶结合物;用底物TMB代替OPD。该法主要以目视法判断结果,整个操作流程仅需20min左右。②硫酸铵沉淀抗原-ELISA:可溶性血吸虫卵抗原经饱和硫酸铵沉淀后用作ELISA诊断抗原;在系列实验基础上,使操作方法达到规范化;用质量控制图控制检测差异,并以标准曲线单位判断结果;缩短检测时间,节省检测时间,节省试液用量,提高了敏感性,特异性和重现性。

  (八)斑点ELISA

  斑点ELISA(dot-ELISA)是近年新发展的一种ELISA技术,选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体,底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色,然后目测或用光密度扫描仪定量。dot-ELISA可用来检测抗体,也可用来检测抗原,由于该法检测抗原时操作较其他免疫学试验简便,故目前多用于抗原检测。

  操作方法将待检血清作1:1~1:20稀释,用微量加样器将1µl血清点滴于硝酸纤维素膜(NC)上,置于70℃经1h,将NC浸于1%BSA-PBS中,室温摇荡1小时,洗涤2次,加1:1000稀释的McAb酶标记物,室温摇荡2小时,洗涤3次后,加底物3,3'二氨基联苯胺或4氯-1-乙萘酚,15分钟后,流水终止反应,以目视法判断结果。凡显示棕色斑点者为阳性,否则为阴性。以产生棕色斑点反应的最高稀释度为抗原滴度。

  该法简易,快速,适合于现场应用,有广阔的应用前景。现有的资料初步证明具有诊断病人和考核治疗效果,国内已用于血吸虫病,疟疾,丝虫病,棘球蚴病的诊断。国内学者曾比较斑点ELISA和双抗体夹心ELISA用于检测班氏丝虫病人循环抗原。采用相同的单克隆抗体和病人血清进行两种方法对比试验。结果显示两种方法检测的特异性均大于95%,但是它们的敏感性有明显不同,斑点ELISA能检测出血清中0.055ng/ml微丝蚴抗原,而双抗体夹心ELISA仅能测出≥10ng/ml抗原;并且前者不需要特殊的设备,适用于丝虫病流行区。另有报告用单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AsT)检测血清抗原诊断黑热病,效果较为满意,方法上进一步简化,加样以原浓度血清反应,效果最佳。国外还用于旋毛虫病、丝虫病、弓形虫病以及肺孢子虫病的血清学诊断方法。

  (九)免疫酶染色试验

  免疫酶染色试验(immunoenzymic staining test,IEST)是以含寄生虫病原的组织切片,印片或培养物涂片用作抗原进行过氧化物酶特异免疫染色后在光镜下检示样本中的特异性抗体。在蠕虫和原虫感染中均有多种应用。

  操作过程抗原组织作冰冻(5~10µm)或石蜡连续切片(4~8µm)排列于载玻片,经丙酮固定贮存于-20℃备用。原虫纯培养亦可制成分隔涂片,方法均同荧光染色法抗原制片。试验时先将抗原片在稀释的过氧化氢溶液浸泡15分钟,除去可能存在于组织中的内源性过氧化物酶;抗原片用PBS冲洗后经Tris缓冲液(PBS,pH7.6)10倍稀释的正常兔或羊血清培育10分钟,迅速以PBS洗涤后加检测样本(单个或系列稀释度),置湿盒室温(20~25℃)或37℃培育30分钟;PBS洗涤3次,每次5分钟,然后加兔或羊抗人过氧化物酶结合物(参照ELISA法),结合物中可加入所用抗原组织片供体动物血清约1/25~1/3体积,用以阻断可能交叉反应,降低背景色度;抗原片以PBS洗涤3次后加联苯胺(DAB)底物溶液(饱和联苯胺液加等量pH7.6硼酸缓冲液,用前按9:1体积加入0.1%H2O2液),室温显色10~15分钟后在光镜下观察反应结果。

  反应标准:“-”,组织内抗原部位不呈现棕红色;“+”,组织内抗原部位(如血吸虫肝卵切片中的虫卵)呈现棕红色;“++”,局部呈现清晰的棕红色;“+++”,呈现非常清晰的棕红色。

  该法简单,节省抗原;判断结果不需要特殊仪器;适合于现场应用。IEST可用作辅助诊断病人,考核疗效,血清流行病学调查及监测疫情的方法。目前主要应用于血吸虫病、丝虫病及囊虫病诊断,也可用来诊断华支囊吸虫病、肺吸虫病、包虫病和弓形虫病。

  目前对该方法改进有:①用感染鼠肝组织内虫卵制成7µm厚度冰冻切片(或石蜡切片)作为诊断用固相抗原代替可溶性血吸虫卵抗原作IEST,具有取材容易和应用抗原经济的优点。②将冰冻切片置于载玻片上,可以反复使用载玻片,较一次性用的PVC薄膜/苯氯乙烯反应板价廉,显著地降低了检测费用。③判断结果时,应用普通光镜即可。染色标本不必即时检查。可保存很长时间,便于复查。④阳性血清作最高滴度,可定量抗体水平,用作考核疗效有及防治效果的指标。⑤IEST的反应基本原理与COPT相似,但前者应用切片虫卵代替了COPT的整个干卵,前法的反应快速(约1.5~2小时)而后法较缓慢(需48~72小时)。为此,IEST弥补了COPT诊断时,漏检病人和取得结果不快速的缺陷。病鼠肝组织内虫卵冰冻切片抗原IEST,目前已在疫区扩大应用。现已研制成试剂盒,批量生产,供应现场需用。

  (十)免疫印渍试验

  免疫印渍试验(immunoblot或Western blot)是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术(immuno-probing  technique),是用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法,近年已应用于检测寄生虫感染宿主体液内针对某分子量抗原的相应循环抗体成分或谱型。是为一项高敏感和高特异的诊断方法,具有很大发展潜力。用于诊断的免疫印渍试验以采用酶标记的探针(即二抗及其标记结合物)为安全方便,称酶免疫转移印渍试验(enzyme  immuno-transfer blotting,EITB)。

  1.操作程序(以血吸虫EITB为例)

  ⑴样本分离:

  1)取日本血吸虫新鲜成虫按5~10对/1.5ml比例加样本缓冲液,匀浆,置沸水浴2分钟,离心(10000g,30分钟),取上清液备用。
2)上述成虫抗原样本进行单梳SDS-PAGE电泳分离。左侧梳孔加标准分子量蛋白,梳孔右侧样槽加抗原液,电压控制在160~180V之间。

  ⑵电泳转印:

  1)从电泳板中取出已完成电泳的凝胶片浸泡于盛有转印缓冲液(TB)的搪瓷盘 内。
2)在TB液内组成转印夹心板层:取相应大小的硝酸纤维(NC)薄膜,徐徐浸泡在TB液,将凝胶片与薄膜光面紧贴。两面各放置浸湿滤纸两层而后海绵垫(厚0.5~1cm)一层,做好方位标记,最后夹于二层有孔塑料衬板之间,绝对避免各层之间留有气泡。
3)将TB倒入转印槽中,然后插入转印板,使凝胶片位于阴极侧,NC薄膜位于阳极侧。
4)置转印槽于4℃冰箱内,通电转印数小时或过夜,电流控制在250mA上下(约40~50V)。

  ⑶探针检测:

  1)取出转印好的NC薄膜,水平地放入猝灭剂中,室温摇动1小时以封闭未吸附蛋白质的区域,然后用洗涤缓冲液选2~3次,每次30分钟以除去亦性剂,使蛋白质的天然状态和生物学特性得以恢复。
2)平置NC薄膜于浸有Tris-缓冲盐水(TBS)的滤纸上,用刀片将薄膜按电泳方向分割为宽约0.5cm的直条,用铅笔做好上端标记。
3)取其中一个细条,并同标准蛋白条带一起作氨基黑染色(也可用考马斯亮蓝染或银染)测试分离效果并确定分子量位置。其余细条晾干后置4℃作印渍试验备用(抗原活性可保持3个月以上)。

  ⑷印渍试验:

  1)置上述抗原条于分格反应板的反应槽内,正面向上,每槽一条,预先用0.05%TBS-Tween液浸湿(TBS-T);
2)被检血清用TBS-T液稀释(常用1:150),加入反应槽中,以浸没膜条为限。通常需0.5~1.5ml,相当于10µl血样量(每槽加液量下同);
3)室温(20~25℃)振荡60分钟,以后用TBS-T洗6次,每次3分钟;
4)加已稀释的羊抗人酶结合物,温育1.5小时,洗涤如上;
5)加入新鲜配制的底物溶液(TBS50ml+0.3%萘酚甲醇液3ml+30%H2O210µl;或二氨基联苯胺,DAB,5mg/ml 0.05mol/L柠檬酸磷酸缓冲液,pH5.0,每60ml加3%H2O220ul和1%COCl20.2ul 和1%COC120.6ml);
6)15分钟后用蒸馏水冲洗数次以终止反应,薄膜条取出置玻板自然干燥;
7)阳性反应可见蓝黑色(4氯1萘酚底物)或棕褐色(DAB)条带。

  2.主要试剂

  ⑴样本缓冲液:含甘油10ml,2-巯基乙醇5ml,10%SDS30ml。
⑵转印缓冲液(TB):Tris 3g,甘氨酸14g,甲醇250ml,水加至1000ml。
⑶Tris缓冲盐水(TBS):10mmol/L,Tris含0.9%NaCl,用1N HC1调pH至7.4。
⑷TBS-T液:TBS液内含0.05%Tween-20于TBS液。
⑸猝灭剂:1%~5%BSA或0.1%~0.3%Tween-20于TBS液。
⑹氨基黑染液:0.1%W/V氨基黑(C. I. 20470),45%V/V甲醇,10%V/V冰醋酸。

  脱色液:90%V/V甲醇,2%冰醋酸。

  EITB用作鉴定寄生虫抗原的特定组分蛋白及诊断寄生虫病的方法。在国外已成功地用于艾滋病的常规诊断,并且在疟原虫、弓形虫、血吸虫、肺吸虫、包虫等的研究分析方面有很多报道。国内用于检测包虫病患者血清抗体也获良好结果,初步应用于血吸虫感染现场调查,用上述抗原及操作程序可检示特异的抗肠相关31/32kD诊断蛋白抗体的条带,呈现特异和敏感的特性。用本法对感染宿主不同病期抗体谱型的研究,可望获得有效化疗后早期隐退的特异条带。批量制备抗原分离的薄膜条带,有可能成为适用于现场查病的特异性诊断药盒,不铁为一项具有诊断潜能的新技术。

  (十一)杂交瘤技术制备单克隆抗体

  经十多年的研究,单克隆抗体(McAb)广泛用于寄生虫病临床与实验研究。如寄生虫虫种与虫株的分型和鉴定;建立以检测循环抗原为主的免疫诊断方法;分析和纯化抗原制备靶抗原;以及寄生虫感染免疫,保护性免疫和虫苗制备等方面,目前,国内外有报告,McAb用于疟疾、弓形虫病、血吸虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、丝虫病等方面。有关McAb在疟疾中的应用,如对虫种,虫株的鉴定与分型,通过采用McAb对环孢蛋白(circumsporozoite  protein,CSP)抗原及裂殖体糖蛋白研究,为疟原虫分型鉴定提供了新的依据;单克隆抗体的应用又为提高临床免疫诊断价值提供了极好的工具,近年来,国内已有报告采用McAb双夹心斑点金银染色法和双夹心斑点酶联免疫吸附试验以检测疟原虫循环抗原,阳性率分别达90%~93.3%和85%~86.7%,具有较高的特异性和重复性,另外发现某些抗子孢子、裂殖体(子)和配子体的单克隆抗体具有保护作用。保护性McAb的发现不仅为制备虫苗的靶抗原提供了条件,而且为进行被动免疫开辟了途径。

  在血吸虫病方面,单克隆抗体已应用于血吸虫抗原分析,免疫学诊断和保护性免疫研究,国内外均已报道采用检测血吸虫循环抗原,如Sj23,Sm38,Sj70等抗原,其阳性率在90%~97%,交叉反应低且有良好的疗效考核价值,有关保护性免疫研究方面,主要集中在分子量分别为28kD和38kD的抗原,现有资料初步表明以McAb提纯的28kD抗原免疫大白鼠后,可获得70%的保护率。

  在丝虫病方面,应用杂交瘤技术已制备出识别马来微丝蚴表面分子量分别为70kD、75kD、110kD等抗原的McAb,某些McAb能介导巨噬细胞粘附于微丝蚴表面,引起虫体死亡。将这些McAb被动转移给受体动物,在体内能降低微丝蚴血症。

  (十二)DNA探针技术

  DNA技术(probe)技术,又称核酸分子杂交(molecular  hybridization)技术,最近几年迅速发展起来的一种敏感性高,特异性强,应用面广的研究手段。在寄生虫病诊断中,探针是病原体的特异核酸序列,可用来检测出病原体是否存在,其关键环节在于获得特异的核酸探针。近10年来应用特异的核酸探针鉴定寄生虫和诊断寄生虫病的研究报道较多,现有资料表明,DNA探针检测,其特异性和敏感性高;并且DNA探针是直接检测寄生虫的基因,故比血清学方法可靠;又因探针DNA较稳定,在合适条件下可较长期保存;在试验条件不变时试验结果的重演性较好。在寄生虫病的诊断、现场调查、寄生虫种的鉴定及分类等方面的研究中均已使用了DNA探针技术,内容包括原虫、吸虫、线虫、绦虫、昆虫的鉴定和致病的诊断。另外,核酸探针已成功地用于许多传播媒介体内寄生虫的鉴定。但是一般尚在实验阶段。可望能用作高效和准确的寄生虫病血清学方法,用以制备经济和理想的诊断抗原。

  (十三)PCR技术

  检测病原体遗传物质用以诊断寄生虫病的方法,除分子杂交技术外,新近发展的更灵敏、快速,并且不需要同位素标记的基因扩增技术,如聚合酶链反应(polymerase  chain reaction,PCR)是一种体外扩增特异性DNA技术。

  现已使用PCR技术于寄生虫病诊断,如锥虫病、利什曼病、肺孢子虫病、肠球虫病、贾第虫病、弓形虫病等,在一些疾病中,有时原虫数量极少,用一般方法无法检测,经用PCR扩增DNA模板,提供了一条解决诊断的途径。如在检测锥虫时,PCR扩增纯化DNA可使探针检测到血样中1个虫体;国内建立了弓形虫病PCR诊断方法,具有高度特异、敏感且快速的优点。今后在寄生虫学领域中将会更广泛深入地开展PCR技术的应用。

(石佑恩)

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