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第四节 寄生虫标本的保存

来源:www.bioon.com 2007-08-08 12:21

第四节 寄生虫标本的保存

  寄生虫标本的保存,除制成玻片标本永久保存外,还可用以下各种保存方法。

  一、原虫包囊和虫卵的保存

  汞碘醛液10ml与粪便1g混匀后密封在瓶内,可保存其中的原虫包囊及虫卵数月之久,也可在经浓集法处理的粪便沉渣中加等量或1倍量的10%甲醛液(加热至70℃),摇匀,用石蜡封固瓶口。

  二、蠕虫成虫的保存

  1.线虫 生理盐水洗净后用加热至70~80℃的70%酒精或巴氏液(甲醛3份,生理盐水97份固定,冷却后移至新的70%酒精或巴氏液中保存。小型线虫(如旋毛虫、蛲虫、钩虫等)宜用甘油酒精(70%酒精95ml,甘油5ml)加热固定,保存于80%酒精中;也可用冰醋酸固定约半小时后移入70%酒精或甘油酒精中保存。

  2.吸虫 小型吸虫可置于小瓶中,加生理盐水,用力摇荡数分钟,倒去生理盐水,注入固定液。较大的吸虫应先放在薄荷脑酒精液(薄荷脑24g,95%酒精10ml)中,使虫体肌肉松弛,用载玻片压平后固定,或将洗净后的吸虫放在两片载玻片间用细线紧扎压平后固定。

  固定一般用10%甲醛,24小时后移至5%甲醛中保存;或用70%酒精固定0.5~3小时,视虫体大小而定,再移至新的70%酒精中保存。

  3.绦虫 大型绦虫(如猪、牛带绦虫)经清水洗涤数次后,在生理盐水(4℃)中经过数小时或过夜,虫体可完全伸展,此时以3%福尔马林固定,24小时后移至5%福尔马林中保存,必要时也可先用大玻璃板压平后固定。小型绦虫洗涤后可在3%福尔马林中固定3~5小时,用载玻片轻压,沿盖玻片边缘加5%甲醛固定数小时,最后保存在5%福尔马林溶液中。

  三、昆虫的保存

  1.干标本保存系保存有翅昆虫成虫。可用特制的昆虫针针插虫体。大型昆虫(蝇、虻等)用1~3号昆虫针,从虫体背面、中胸右侧直插(图21-9)。注意保持左侧完整,以便鉴定。小型昆虫(蚊、蛉、蚋、蠓等)可用00号短针自胸部腹面两中足基部之间插入,不可刺透胸背,再用另一长针从软木片另一端插下。最后各插一硬纸片,记录名称、采集地点与时间,并将之插于昆虫盒软木板上或玻璃管的软木塞上。昆虫盒内放入纸包的樟脑粉即可。如标本数量多(图21-9),可保存于塑料管(或
玻璃管)中,管底放少量樟脑粉,再铺上棉花、滤纸各一层,昆虫标本放于滤纸上,用软棉纸包棉花,轻塞在昆虫标本上方,瓶口加软木塞,再以蜡封之。

图21-9 有翅昆虫针插法

  2.湿标本保存用于保存有翅昆虫的卵和幼虫期及无翅昆虫和蜱螨类的发育各期。活标本先经加温的70%酒精(60~70℃)固定,一天后保存于5%甘油酒精(7%)中;也可用5%或10%福尔马林和Bless液固定保存。

  所有保存标本须详细记录标本名称、宿主、采集地点、采集日期及采集者姓名。

  樟脑混合剂配制:樟脑粉6份,氯仿1份,木馏油1份,石蜡油4份。先将樟脑粉1.5份与氯仿1份混合,随后加樟脑1.5份与木馏油1份,用玻璃棒混匀,最后加樟脑粉3份及石蜡油4份,再搅匀备用。此混合剂易燃,宜置于严密而不透气的瓶内储藏。

  常用固定液配制:

  ⑴酒精:通常用70%或75%酒精为固定液。用商品供应95%酒精作稀释配制。取95%酒精加至需要稀释的浓度,再加蒸馏水到95ml即可;或者,可按下列稀释公式配制:

     所需酒精浓度  ×配成酒精量=所需原酒精量(ml)
 原酒精浓度

配成酒精量-所需原酒精量=应加蒸馏水量(ml)

  ⑵福尔马林(37%~40%的甲醛水溶液):常用固定液的浓度为5%~10%。如需保持中性,在配制过程中,可在500ml原液(37%~40%的甲醛水溶液)加入约2cm厚碳酸镁,或放几小块大理石(碳酸钙)中和之;也可采用下列配方配制(10%福尔马林):福尔马林原液100ml,蒸馏水900ml,碳酸二氢钠(Na2H2PO4·H2O)4g,碳酸氢二钠(Na2H2PO4)0.5g混合配成。

  ⑶布氏(Bless)液:福尔马林原液7ml,酒精(70%)90ml,冰醋酸(临用前加入)3~5ml混合配成。

  四、原虫低温保存

  用液氮保存原虫,具有保持原虫生物学特性,且保存时间较长的优点。现仅介绍疟原虫、弓形虫、人毛滴虫及阴道毛滴虫的低温保存方法。

  1.冻存方法

  恶性疟原虫:将从受染者采得的抗凝含虫血或体外培养的培养物,经1500rpm离心10分钟,加入与沉积细胞等量的24%二甲基亚砜(DMSO)生理盐水溶液(0.9%生理盐水或5%葡萄糖生理盐水76ml中加入DMSO24ml)保护剂,充分混匀后在室温中放置30分钟,按0.5~1.0ml分装入无菌安瓿(或塑料管)内,封口(或盖严)后将之放入标明批号的纱布袋中,装于液氮罐的提筒内,先置于液氮罐的颈部,该处约为-70℃,30分钟后,置液氮中(-196℃)冻存。

  鼠疟原虫:从感染疟原虫第3~4天的小鼠心脏取血(或摘除眼球取血),注入试管,肝素抗凝,加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛血清为保护剂;或加入等体积的甘油、山梨醇保护液(4.2%山梨醇生理盐水180ml加纯甘油70ml),充分混匀。按照上法装管及冻存。也可以在1mm3阳性鼠血加0.1mm3的3.8%枸橼酸钠抗凝之后就装于液氮罐提筒中,立即直接置液氮中保存,2年内多数原虫仍有活力。

  弓形虫:用无菌注射器吸取10%DMSO2ml,注入感染4天的小鼠腹腔,抽洗2次,抽出液混匀后即注入无菌塑料管内(0.5~1ml/管),冻存法同上。

  阴道毛滴虫:用无菌拭子取阴道分泌物,放入培养基中培养48小时,转种于RPMI-1640培基中2天。取含虫培养液经1000rpm/min离心10分钟,在沉淀中加入10%DMSO2ml,同上法分装及冻存。

  人毛滴虫:取腹泻患者的含虫粪便培养于洛氏培养基中48小时,转种于洛氏培养基或RPMI-1640培养基中培养2天后计算虫数(达7×105)。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。装管同上法。但冻存过程应先将小管置于-10℃中15分钟,移到液氮罐颈2分钟,再置入液氮中冻存。

  上述所用的保护剂(液)均应经高压灭菌,保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO,用时再稀释所需浓度,加15%或20%小牛血清,调pH至7.2。

  2.复苏与观察在冻存1~2年,需要时从液氮罐中取出保种的小管,迅速投入37~40℃温水中,经4~5分钟即溶化。取冻存的鼠疟原虫和弓形虫分别经腹腔接种2只小鼠,每只0.2ml,观察致病情况;也可接种后4~5天分别取鼠血或腹腔液,作涂片,姬氏液染色,镜检原虫。两种毛滴虫可用同样方法复苏,但需经培养3~4天后,作涂片镜检活动滋养体,或染色观察。

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