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肺泡2型细胞的分离培养

来源:来源网络 2007-07-24 15:54

1、  称体重:
2、  腹腔内注射苯巴比妥钠50mg/kg将大鼠处死,用酒精严格消毒大鼠下颌至全腹皮肤及鼠毛,剪开下颌至中腹部皮肤,打开腹腔,推开肝脏并分离出肝及膈肌间的下腔静脉并给予切开放血。
3、  肺血管灌洗:分离并部分横断切开气管,插入连接有10ml注射器(内装pH7.0PBS)的灌洗管并用细线加以固定,在固定的离心段剪断气管,剪开肋骨并打开胸腔将肺和心脏提出胸腔。用20号针(另一端连接20ml的注射器)穿刺进入右心室并顺着右心室插入到肺动脉进行肺血管的灌洗。直至左心房流出清亮液体,将肺和心脏、气管一起取下,灌洗成功的肺呈苍白色。
4、  肺印片:革兰氏染色、改良GMS染色,
5、  支气管灌洗:通过注射器行支气管肺泡灌洗,每次灌洗10ml,连续7~8次,回收40~50ml支气管肺泡灌洗液(brochialaloveolarlavagefluids,BALFs)。将BALFs离心30min(2000r/m),弃上清再混匀沉淀物,加入DMEM移入培养瓶中培养。
6、  取不同断面的肺组织,甲醛固定,留作切片。
7、  胰酶消化:经气管注入胰酶15ml,37度水浴,消化20分钟,间隔10min补加胰酶10ml.。将肺在2ml DNase中剪碎,,摇床重震荡5-10分钟, 100目————200目过滤,用显微镜观察消化情况,加5ml 血清中止消化,4度,1000r/ml离心10分钟,3mlDMEM悬浮细胞。Percoll梯度离心,DMEM洗,培养。
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