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质粒DNA的提取与纯化

来源:来源网络 2007-04-02 16:28

一、实验目的与原理
质粒多为一些双链、环状的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步:①细菌的培养和质粒的扩增,②细菌菌体的裂解,③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法,质粒纯化方法为梯度离心法。
二、材料与试剂
1、材料:大肠杆菌
2、仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪
3、试剂:
Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
10 mM EDTA(pH8.0)
50 mM葡萄糖
高压灭菌,4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高压灭菌,4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌,4℃保存。异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂
三、操作步骤
1、细菌繁殖
LB培养基,2 ml/20ml,37℃,200rpm,摇一摇,过夜
2、离心10 min,5000 rpm, 4℃;弃上淸液
3、沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5000 rpm, 4℃
加入预冷的1 ml Solution I,冰浴,10 min
4、重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴,5 min
6、加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min
8、离心10 min,12000 rpm, 4℃
9、取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中
10、加入40 ul,3 M NaAc
11、酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀
12、离心10 min,12000 rpm, 4℃
13、取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14、电泳检测提取DNA的质量
三、结果与分析
超螺旋结构DNA

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