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TCA沉淀方法

来源:丁香园论坛 2007-01-18 19:46

培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看,可以TCA沉淀浓缩后跑电泳,一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带,这是我用的TCA沉淀方法,效果很好:
1.菌液10000g,离心5分钟,收集表达上清。
2.取500-1000ul上清于EP管中,加入1/9体积的100%TCA,颠倒10次混匀。
3.样品置于冰浴中大于0.5小时,过夜效果更好。
4.15000g,离心10-20分钟,可见有棕黑色沉淀,倒掉上清,将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下,除去残余在管口的液体。
5.将EP管倒置于吸水纸长,37度烘箱10-20分钟,待管底无明显液体残留,如果管壁还残留有液体,可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风,关键是除去管底和管壁残余液体。
6.15000g,离心10-20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体,此步骤要快,不然沉淀容易散开,降低蛋白回收率,一般最多几ul或者没有,注意不要吸到沉淀。
7.EP管倒置于吸水纸长,37度烘箱5分钟,确认管壁和管底没有液体残留。
8.加入20-50ul Loading buffer,95度加热10nim,一般沉淀会自动溶解,如果不溶,用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打,注意整个操作尽量不要碰到管壁,因为管壁可能沾有残余TCA。如果蓝色的Loading buffer不变成黄色,说明残余TCA吸弃了干净,如果变黄,一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了,而且不影响电泳效果。
或者第5步和第6步改为丙酮洗:
5.加入200ul冰冷的丙酮,用手指轻弹EP管,洗去管底和管壁残余的TCA。
6.15000g,离心10-20分钟,倒掉上清,将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下,除去残余在管口的液体。
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