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人NK 细胞克隆的制备

来源:来源网络 2006-12-23 15:48

基本原理
NK 细胞克隆来源于NK 细胞,该细胞的分离方法参见第一节之四。这些NK 细胞与经γ射线照射的饲养细胞苓而获得的NK 细胞克隆

试剂和材料
● 植物血凝素(PHA)母液为100μg/ml
● 重组IL-2(rIL-2)母液为105u/ml,分装小瓶(0.5ml/瓶),置-20℃长期保存,或置4℃下短期存放。应避免反复冻融,IL-2 不能用滤器过滤除菌处理。
● 培养基
1.接种培养液:RPMI1640+10%FCS+0.5μg/ml PHA+200u/ml IL-2+10g/L 谷氨酰胺+100u/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素+1mmol/L 丙酮酸钠。
2.饲养细胞培养液:RPMI1640+10%FCS+10g/L 谷氨酰胺+100u/ml 青霉素+100μg/ml链霉素+1mmol/L 丙酮酸钠。
3.NK 克隆培养液:RPMI1640+10%FCS+10g/L 谷氨酰胺+100u/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素+1mmol/L 丙酮酸钠,经0.2u 滤板过滤再加入100u/ml IL-2。
4.培养液:RPMI1640+10%FCS。
● 饲养细胞:自体或同种异体PBMC
● 器皿和仪器:96 孔细胞培养板、多头移液管、微量移液管、倒置显微镜、CO2 孵箱、低温离心机、垂直气流超净台

实验操作
1.NK 细胞的制备
1) 制备NK 的方法参见第一章之第四节。
2) 悬浮NK 于接种培养液中,细胞浓度调至106/ml。
2.接种NK 细胞
1) 制备饲养细胞(PBMC)方法参见第一章第一节。
2) 于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。
3) 被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中,细胞浓度调至2×106/ml。
4) 用强度5000radγ射线照射饲养细胞,于4℃用300×g 离心饲养细胞12min,将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中,饲养细胞浓度调至2×106/ml。
5) 在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液(总量用60ml 饲养细胞悬液,含1.2×108 个饲养细胞)。
6) 将96 孔板置37℃孵箱预温,直到加入NK 细胞。
7) 将NK 细胞悬浮于接种培养液中,并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞,使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2.5 细胞/孔的三种类型板,而且每种类型重复二块板。
8) 将培养板置5%CO2 孵箱中37℃培养。
3.NK 细胞的再刺激(接种后2-3 天,主要依赖于饲养细胞)
1) 从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。
2) 每孔中加入含有经照射的饲养细胞(2×106 细胞/ml)的NK 克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下:
(1) 融化饲养细胞,移至50ml 试管中。
(2) 轻轻地加入培养液30ml,混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。
(3) 用300×g 离心饲养细胞12min,并计数饲养细胞数量。
(4) 按细胞计数结果,将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中,调至细胞浓度为2×106/ml。
4.换液(6-8 天)从每孔中轻轻移弃100μl 上清液,并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。
5.检测NK 细胞的生长状况(9-10 天)如检查有细胞生长,按第8 天的操作换液。
6.分离克隆(11-15 天)
1) 当培养液颜色变黄时,证明细胞已生长,在96 孔板上将生长的NK 按1 孔分为2 孔,2 孔分为4 孔,4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。
2) 在96 孔板上扩增克隆,并重复第7 天的操作。

质控与提示
1.每天需检查细胞生长情况。
2.NK 细胞克隆只生长在96 孔板上,NK 细胞总是用96 孔培养板进行克隆培养。
3.目前了解,鼠NK 细胞克隆的制备仅限于短期培养。
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