新功能、新界面、新体验,扫描即可下载生物谷APP!
首页 » 产生RNA干扰RANi 的方法

产生RNA干扰RANi 的方法

来源:来源网络 2006-11-22 23:35

4 产生RANi 的方法
产生RANi 的方法主要有体外合成和体内合成siRNA 法。将siRNA 导入细胞的方法又分为微量注射法、电穿孔法、浸泡法、工程菌喂养法、转基因法和病毒感染法等。
Harborth 等[14 ]设计体外合成21nt siRNA 的方法是:在基因库中寻找靶向基因的mRNA 序列,并从起始密码后的第75 位碱基开始寻找AA + N19 + UU 序列或AA + N19 序列,其中N19 为任意19nt 的mRNA核苷酸序列;然后设计选定序列中的G+ C 的比例为30 %--70 %;对确定的序列用Blast 搜寻EST基因库,确定所靶向的基因是唯一模簧杓?1 个反义RNA 序列,并用SiACE2RNAi 方法合成两条RNA 链,在其两链的3’末端最后2 个核苷酸设计合成dTdT序列,以减少细胞内降解。他们用体外合成的21 个核苷酸组成的siRNA 分别转染人和大鼠细胞株,作用于NumA 等16 个基因,使这些基因的表达均受到明显的抑制。
1998 年,Fire[1 ] 等用微量注射法将体外合成的dsRNA 注射到线虫体内,观察到dsRNA 可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞,并且RNAi 效应可以遗传至下一代,在子代仍抑制靶向基因的表达。并且给幼虫喂食可表达双链RNA 的细菌,或将幼虫浸泡在含有dsRNA 的溶液中,也能观察到特异的突变表型。
由于RNA 易于被RNA 酶分解,而且不论是生物合成还是化学合成dsRNA,成本均较高且费时,这在一定程度上限制了RNAi 技术的应用。在细胞内合成siRNA 诱导RNAi 的技术,大大削减了实验成本,增加了实验的可操作性。
Miyagishi[15 ]等建立了U6 启动子驱动的体内siR2NA 合成方法,成功地抑制了靶基因在哺乳动物细胞中的表达。他们设计构建了两个U6 启动子分别引导19nt 的siRNA 的正义链和反义链的合成,两段RNA 在细胞内退火连接成为双链RNA。Sui 等也构建了U6 启动子控制的siRNA 表达质粒,不同的是siRNA 模板为回文结构。在U6 启动子下游依次是siRNA 21nt 编码序列、6nt 的间隔序列、反向的siRNA21nt 编码序列及由5 个T 寡核苷酸尾组成的转录终止序列。这个质粒诱导合成的RNA 为发夹样双链结构。发夹样双链结构的RNA 比由正义链和反义链在细胞内退火后合成的dsRNA 似乎更能有效地抑制靶基因的表达。Brummelkamp[16 ]等构建了pSU2PER 质粒载体,应用了聚合酶ⅢH12RNA 基因启动子起始RNA 的合成。通过模板设计,使体内合成的siRNA 呈发夹样结构,并且能修饰3’端形成两个尿苷酸的突出结构,与化学合成的siRNA 结构相类似。为了使RNAi 技术成为可以控制的诱导基因沉默的方法,Miyagishi 等还建立了四环素调节的U6 启动子系统,通过控制U6 启动子就可以指令RNAi 在特定的时间发生作用。并且经克隆筛选,拥有细胞内siRNA 表达系统的细胞株可以长久保存并随时复苏使用。此外,一些在动物发育过程中起关键作用的基因,如果在DNA 水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰,则可能会过早地导致基因沉默,产生致死表型,使研究无法继续进行。dsRNA 的表达受特异启动子的控制,可以有目的地在特定的时间启动RNAi 。控制RNAi 在发育阶段开始启动,可以研究发育早期的关键基因在发育后期的功能。
尽管质粒介导的RNAi 有上述众多优点, 但DNA 的转染多以瞬间表达为主,最长也不过几天。并且在某些种类的细胞,转染率很低,即使在同种细胞中,转染率也大不相同。为此,逆转录病毒和腺相关病毒[17,18 ]等也被用做载体。其原理是类似的,都是携带启动子和DNA 模板,在细胞内指导合成siRNA。所不同的是病毒载体介导的siRNA 合成更快速、一致和稳定,即使在某些非分化、原代培养的细胞中,转染率也能达到100 %。
Eric 等先将指导发夹样结构siRNA 合成的寡核苷酸序列克隆到pBS/ U6 载体,然后将U6 启动子和与靶基因互补的寡核苷酸序列酶解切割下来,用Klenow补平粘性末端后,再插入pMSCVpruo 中。应用这种逆转录病毒载体,他们成功地抑制了一种人类丝氨酸/ 苏氨酸激酶(NDR) 基因的表达。Changxian 等将H1-RNA 启动子序列和编码p53 基因的引物寡核苷酸序列克隆到无启动子序列的运输质粒pShuttle 上,然后将pShuttle253 与pAdEasy-1 重组,得到两个重组腺病毒DNA ,AdH1-53 和AdH1-empty。他们也成功地观察到了AdH1-53 诱导的p53 缺失表型。
噬菌体启动子启动下的转录技术也被应用到产生RNAi 中。Liang[8 ]等证实组成性细菌噬菌体λ启动子pL 的转录活性提高了2—3 倍。LaCount 等也用细菌噬菌体启动子T7 诱导了绿色荧光蛋白等基因表达沉默。
另外一项新进展是对5’UTR 和3’UTR 调节元件功能的研究。以往在设计dsRNA 的序列时一般均针对靶基因的外显子序列,含有内含子和启动子序列的dsRNA 一般不能产生
RNAi 。但最近发现RNAi 可以作用于5’非翻译区( 5’UTR) 或3’UTR[20 ,21] ,引起靶基因的沉默。Doench 等发现在培养的哺乳动物组织中,小干扰RNA 能与靶mRNA 的3’UTR 部分互补序列结合,抑制其表达,这与已证明的内源性编码miRNA 的功能相类似。Eckmann 等发现RNA 结合蛋白FBF 通过与调节元件fem-3 的3’UTR 结合,影响线虫精子的形成,从而决定卵的命运,并抑制决定性别的基因的表达。Yokota 等发现在HCV 基因组中,5’UTR 是一个高度保守区,这使之成为siRNA 理想的靶点。他们设计的siRNA 靶向结合HCV 基因组中的5’UTR ,抑制了病毒蛋白的合成。这些发现使科学家能够分析包含在5’UTR和3’UTR 内的调节元件的功能。如胚胎的发育过程完全依赖于mRNA 和蛋白质在正确的位置和时间内的表达或表达阻抑。用绿色荧光蛋白标记启动子或感兴趣基因的3’UTR ,也使实时跟踪基因表达和蛋白质形成的位置更加简易,不需要对组织有损伤的组织固定过程和特异性抗体的原位杂交。
14 Harborth J , Elbashir SM, Bechert K, et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J Cell Sci , 2001 , 114:4557~4565
15 Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotech , 2002 , 19:497~500
16 Brummelkamp TR , Bernards R , Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science , 2002 , 296:550~553
17 Brummelkamp TR , Bernards R , Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus
mediated RNA interference. Cancer Cell , 2002:243~247
18 Devroe E , Silver PA. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol , 2002 , 2:15
19 Liang ST, Bipatnath M, Xu YC , et al. Activities of Constitutive Promoters in Escherichia coli. Mol Biol , 1999 , 292:19~37
20 Doench JG, Petersen CP , Sharp PA. siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev , 2003 , 17:438~442
21 Eckmann CR , Kraemer B , Wickens M, et al. GLD-3 , a bicaudal-C homolog that inhibits FBF to control germline sex determination in C. elegans. Dev Cell , 2002 , 3:697~710
温馨提示:87%用户都在生物谷APP上阅读,扫描立刻下载! 天天精彩!


相关标签

最新会议 培训班 期刊库