Cell论文揭示毛发器官发生4D图谱：厚组织空间转录组学揭示发育动态的隐藏维度

器官形成是一个动态过程，涉及新细胞类型的有序涌现，以及它们协调生长并组装成具有特定功能的三维（3D）结构。要理解这一过程并表征其在先天畸形中如何被破坏，需要在时间和空间两个维度上同时追踪。虽然大体解剖变化可通过超声或磁共振成像（MRI）等影像方式追踪，但在分子水平——即遗传程序驱动细胞行为的层面——实现时空追踪则极具挑战性。现有方法通常需要牺牲分子细节（如活体成像）、空间组织信息（如解离的单细胞图谱）或时间分辨率（如空间图谱）。要捕捉器官组装的完整动态，需要同时在三维空间和跨时间维度进行映射——即四维（4D）映射。

毛囊作为一种微型器官和哺乳动物的定义性特征，为器官发生的4D映射提供了独特契机。与其他器官不同，毛囊在胎儿期和出生后早期持续被诱导产生。在这一时间窗口内的任何时刻，皮肤中都包含大量处于不同发育阶段的毛囊。这种异步性使连续采样方法复杂化，但结合毛囊的小尺寸，却创造了另一个机会：在单个空间快照中即可捕获数百个涵盖完整器官发生轨迹的毛囊，并按发育阶段排序，从而从单张空间图像重建器官发生的时间维度。

尽管毛囊形成在4D映射方面具有独特性，但它涉及的发育过程与其他器官共享，包括不同胚层之间的协调。表皮谱系（外胚层）贡献角质形成细胞——这是毛囊的主要细胞类型，在毛囊形成过程中向内凹陷进入真皮，形成毛囊结构的主体并最终产生毛干本身。神经嵴谱系（外胚层）主要贡献黑素细胞，这些细胞从皮肤表面迁移至毛囊内，为毛发提供色素。真皮谱系（中胚层）贡献成纤维细胞，形成包绕毛囊的真皮鞘和位于毛囊球部基底的真皮乳头（DP）。这些成纤维细胞在毛囊形成过程中提供指导信号，并在整个生命过程中调控其再生。因此，毛囊既具有4D映射的独特可及性，又对理解不同细胞类型在器官发生过程中如何出现和组织具有广泛的参考价值。

然而，实现这一潜力需要克服一个解剖学难题。毛囊延伸至皮肤下200至400微米（μm）深处，其结构——复杂、弯曲且沿三个轴均非重复——使其难以利用依赖薄二维切片的空间转录组学方法完全捕获。这类方法最适合那些足够大以进行连续切片（如心脏）或至少沿一个轴具有重复性（如神经索）的器官。因此，完整捕获毛囊需要厚组织空间转录组学。

在一项新的研究中，研究团队开发了3D DNase增强表达谱分析（3DEEP）——一种凝胶包埋和组织透明化方法，通过去除基因组DNA来改善探针穿透和酶处理效率，从而在厚达400 μm的切片中实现高信号强度的空间转录组学。将这一方法应用于野生型（WT）新生小鼠皮肤，他们从超过400,000个细胞中鉴定了来自224个基因的3,000万条转录本，分离出超过600个处于不同器官发生阶段的完整毛囊并进行3D重建。

每个毛囊的分子组成反映了其发育阶段，使他们能够计算整个器官的“伪时间”——将毛囊沿其发育轨迹排序，从而创建器官发生的4D分子图谱。该图谱可通过交互式在线浏览器（https://jef.works/CellCarto-3DEEP/）访问，揭示了毛囊器官发生的三个不同分子阶段：第一阶段以轴向 patterning 和干细胞分层为特征，第二阶段为结构多样化和球部形成，第三阶段为快速生长和通道形成。他们同样分析了Foxn1缺陷的裸鼠，捕获了超过400,000个细胞中的2,300万条转录本，分离出262个完整毛囊。比较分析揭示，无毛表型涉及器官范围内发育动态的改变——包括分子进程延迟、协调性降低和不稳定性增加——这些改变先于明显的结构缺陷。总之，这些发现展示了厚组织空间转录组学如何揭示器官组装在四维空间中其他方法无法看到的动态。

在四维空间中重建器官如何发育——三个空间维度和一个时间维度。长期以来受到无法同时跨所有维度捕获分子信息的限制。 在本研究中，他们开发了用于厚组织空间转录组学的3DEEP透明化方法，并将其应用于新生小鼠皮肤，以在其天然背景下捕获数百个处于不同器官发生阶段的毛囊的3D分子组成。通过从分子组成中推导时间维度，他们创建了毛囊器官发生的4D图谱，从而能够在高时空分辨率下系统比较野生型和突变型基因型之间的分化、生长、形态发生和微环境动态。

3DEEP增加空间转录组学的深度

3DEEP将RNA包埋在水凝胶中，同时去除基因组DNA以及蛋白质和脂质，使组织透明化，从而允许试剂扩散、酶反应和成像在数百微米深度进行。在此，他们将3DEEP与HybISS结合用于空间转录组学，在新兴的深部组织空间转录组学方法中形成了可及深度与成像时间的独特组合。然而，3DEEP也可与其他原位转录组学方法和組織擴張技术整合，在这些应用中同样可能带来性能提升。

空间伪时间排序：捕捉发育动态的新范式

本研究的一个关键概念性进展是认识到：在同一样本内异步发育的细胞群，在空间信息得以保留的前提下，可通过计算排序来捕捉发育时间——他们将此方法称为“空间伪时间排序”。毛囊特别适合此方法，因为它们在胚胎发生期间持续被诱导，胎鼠和新生小鼠皮肤含有跨越多个发育阶段的毛囊。这种时间异质性限制了连续采样，但空间伪时间排序将其转化为优势——从单个3D快照中按发育轨迹对毛囊排序，创建4D图谱。该方法应广泛适用于那些类似结构异步发育的系统，包括肾脏肾单位、胰岛和肺泡。随着可成像体积的扩大，空间伪时间排序还可应用于人工异步样本（如混合的斑马鱼胚胎）。

在某种程度上，空间伪时间排序之于连续采样，就如同冷冻电镜（cryo-EM）之于X射线晶体学。X射线晶体学需要均质晶体，而冷冻电镜可从异质颗粒混合物中重建结构。类似地，连续采样需要跨时间点的均质样本，而空间伪时间排序则从空间中捕获的异步发育单元重建发育动态。两种方法都将分辨率限制因素从样本均质性转向了通量，而技术进步往往更有利于通量。正如硬件和计算的进步使冷冻电镜日益强大，体积成像和计算的进步同样可能推动空间伪时间排序的发展。

基于4D图谱的毛囊器官发生分子分期

他们的4D图谱揭示了毛囊器官发生的三个分子阶段。在第一阶段，新生毛囊相对简单，主要由外鞘角质形成细胞和真皮凝聚物组成。值得注意的是，这一早期阶段还见证了一个重要的组织事件：干细胞和微环境细胞沿毛囊轴的分层，该结构维持至成熟期。在第二阶段，毛囊经历剧烈多样化：内部结构（IRS、毛干、CP和DP）开始快速连续分化，导致球部形成。在第三阶段，毛囊体积增大并形成通道。毛囊器官发生的这些分子阶段——轴向 pattern 化，随后是新细胞类型分化，最后是生长和形态发生——与更大器官（如大脑）的发育相似，即轴向 pattern 化先于细胞类型多样化，随后是生长和形态学成熟。

揭示遗传因素对发育动态的影响

胚胎发育的遗传扰动可导致先天畸形。在某些情况下，如Pax6突变导致的无虹膜症，机制明确：特定谱系未能正常形成。其他情况则更为复杂：Chd7突变导致CHARGE综合征（眼缺损、心脏缺陷、后鼻孔闭锁、生长迟缓、生殖器发育不全和耳部异常）——这是一种多器官疾病，受累器官虽能形成但出现畸形，且即使携带相同突变的个体之间表型变异性也极为显著。这第二类突变的发育效应难以定义。

他们对野生型和Foxn1^nu/nu毛囊的比较分析展示了4D图谱如何帮助应对这一挑战。裸鼠出生时毛囊大体正常，但随后无法产生正常毛发：结构受损的毛干在毛囊内折叠而无法穿出。与直觉相反，他们的分析显示裸鼠的通道形成是正常的。相反，在明显表型显现之前很久，发育动态已发生广泛改变：分子成熟相对于增殖普遍延迟，毛囊结构的协调生长发生改变，最终导致毛干生长显著减慢。此外，分子进程的变异性增加。这些观察将裸鼠表型从球部结构局灶性破坏（显微镜下可检测）扩展为全局性但更细微的发育动态改变——否则这些改变将无法被察觉。此处观察到的模式——协调性改变、分子进程减慢和不稳定性增加——可能与其他器官中所有谱系均能形成、但器官结构和功能受到扰乱的先天畸形相关。

毛囊作为发育动力学的模型系统

生物学进展常常利用在解决特定生物学问题方面具有独特优势的模式系统。例如，秀丽隐杆线虫（C. elegans）因其不变的谱系而长期成为研究细胞命运的模式生物。毛囊本身已是再生和干细胞生物学中一个成熟的模型——它是少数能够近乎无限、终身再生的哺乳动物器官之一，且在人类中可及性高、伦理担忧极小。其在脱发、伤口愈合和癌症中的医学重要性进一步增强了其作为模型系统的吸引力。基于本研究结果，他们提出毛囊作为研究发育动态的一个独特优势模型系统，因为其发育轨迹可从单个空间快照重建。这一能力为研究遗传、环境和随机因素如何影响体内发育动态提供了独特机遇。

总之，他们的毛囊器官发生4D分子图谱为理解复杂器官如何在空间和时间中组装提供了高分辨率视图。他们的发现为在四维空间中以分子分辨率研究发育及其扰动建立了新范式。

研究局限性

他们的分析未区分毛囊亚型（护毛、针毛或锯齿毛），也未考虑皮肤内的位置差异；因此，此处呈现的轨迹可沿这些维度进一步解卷积。此外，动态基于伪时间，其与实际时间可能并非线性关系。此外，他们缺乏理解解剖结构起源所需的谱系信息——这需要谱系条形码方法。另外，他们对裸鼠的分析未考虑胚胎发生期间Foxn1表达的变化；不同波次的毛囊可能受到不同程度影响。最后，裸鼠品系为同类系，不能排除部分观察到的差异是由与Foxn1^nu等位基因连锁的非编码变异所导致。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Soichiro Asami et al, Four-dimensional molecular mapping from a spatial snapshot reveals the dynamics of hair follicle organogenesis, Cell (2026). DOI: 10.1016/j.cell.2026.06.014.