Adv Sci：精准"逆向投递"直接通路，浙江大学研究团队合作开发AAV工具包，让D1-MSN靶向调控成为可能

中型多棘神经元（MSNs）是纹状体主要输出神经元，分为两大亚型：表达D1受体的中型多棘神经元（D1-MSNs）与表达D2受体的中型多棘神经元（D2-MSNs）。两类神经元均接收皮层传入信号，但投射通路存在差异：D1-MSNs直接投射至内侧苍白球（GPi）与黑质网状部（SNr），构成直接通路；而D2-MSNs经外侧苍白球（GPe）、丘脑底核（STN）中转后再投射至GPi/SNr，形成间接通路。

GPi/SNr的输出信号经丘脑中继后反馈至大脑皮层。两条通路协同活动对皮层信息处理至关重要。在帕金森病（PD）中，黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元发生退行性病变，打破通路平衡，造成D1-MSNs活性持续抑制。在啮齿类与非人灵长类（NHP）帕金森模型中，恢复纹状体D1-MSNs放电可改善运动迟缓类症状，凸显靶向该类神经元的治疗潜力。

尽管D1-MSNs在基础研究与治疗研发中意义重大，但可特异性靶向并调控该细胞的工具仍十分有限。现有手段主要依赖Cre依赖型转基因小鼠模型，可在D1-MSNs中特异性表达光遗传效应元件，通过恢复D1-MSNs活性实现功能修复，但该基因编辑手段仅适用于啮齿动物，难以向高等哺乳动物与临床治疗转化。

为弥补这一短板，研究者开发了改造型腺相关病毒（AAV）衣壳逆行靶向策略，将病毒注射至SNr，通过轴突末梢转染D1-MSNs。该方法虽在啮齿类与非人灵长类中有效，但仍存在缺陷：其逆行转运基序最初为皮层神经元设计，且不含MSN特异性启动子的裸衣壳无法区分D1-MSNs与皮质纹状体投射神经元。

此外，短近端启动子虽能高效介导MSN内基因表达，但近年增强子设计领域的进展引出关键问题：体积更小的MSN增强子能否在维持细胞特异性的同时，达到同等表达强度？以上问题说明，亟需开发适配基础研究与转化研究的新一代D1-MSNs靶向工具。

定向进化改造AAV9衣壳，提升纹状体-黑质通路神经元的转染效率（图源自Advanced Science）

本研究建立一套完整筛选体系，筛选经SNr注射后可高效靶向D1-MSNs的AAV衣壳与增强子元件，研究流程包括：（1）构建AAV9衣壳插入突变文库，在可变区VIII（VR-VIII）插入7个氨基酸序列；（2）建立基于RNA的筛选方案，提升检测灵敏度。

通过该体系获得新型衣壳突变体，相较于原始AAV9，其转染效率大幅提升，且靶向嗜性偏向D1-MSNs，不结合皮层投射神经元。随后利用人源ATAC测序数据筛选出4个源自RGS9的候选MSN增强子，这类元件在壳核中呈现开放染色质特征，皮层组织中无此特征。

其中两个增强子可驱动目的基因在D1-MSNs中高强度表达。本研究最终构建的工具包整合优化后的逆行靶向衣壳与全新增强子，可在啮齿类与猕猴大脑中特异性标记D1-MSNs，并实现外源基因高表达。

功能验证实验证实，该工具可在D1-MSNs中特异性表达仅由人工配体激活的人工受体（DREADD）；在健康小鼠中可诱发对侧旋转行为，并显著改善帕金森模型小鼠核心运动功能缺损。

参考消息：https://doi.org/10.1002/advs.202519665