上海交大实现吡咯并吲哚类生物碱的集约式生物合成

近日，国际权威期刊Angew Chem Int Ed在线发表了上海交通大学生命科学技术学院和张江高等研究院瞿旭东教授与孔旭东长聘教轨副教授课题组的合作成果“Engineering the Substrate Specificity of a P450 Dimerase Enables the Collective Biosynthesis of Heterodimeric Tryptophan-Containing Diketopiperazines”。瞿旭东教授、孔旭东长聘教轨副教授为论文的共同通讯作者，博士后孙成海和马宝娣为本文的共同第一作者。

异源二聚化吡咯并吲哚是一类重要的生物碱，其丰富的结构多样性赋予了多种多样的生物学活性，因此拓展该类生物碱的结构多样性对于深入探索其生物活性具有重要意义。在前期工作中，瞿旭东教授课题组发现了首个能够合成该类生物碱的二聚化P450酶NascB，并解析了其催化机制（Nat Commun 2018, 91, 4428）；阐明了二聚环化P450酶催化反应过程中的区域/立体选择性机制，并利用酶工程方法实现了底物偶联方式的精准控制（Nat Commun 2020, 11, 6251）；开发了分枝杆菌全细胞催化体系用于该类生物碱的高效生物合成，发现了其该骨架具备优异的神经保护活性（J Org Chem 2021, 86, 11189）；以及对吡咯并吲哚类生物碱进行了系统总结并提出了新的分类方法（Nat Prod Rep, 2022, 39, 1721）。不过由于目前已知的P450酶对上方底物的选择性极为严谨（只能识别cWLPL, cWLAL, cWLVL），因此要深度开发此类生物碱的药学用途，还需要解决P450酶的底物识别专一性问题，突破吡咯并吲哚生物碱结构多样性少的瓶颈。

在本项研究中，联合课题组通过基因组挖掘和进化分析，首先发现了一例可识别底物cWLFL的新型二聚化酶NASAO。进一步通过序列和结构分析，发现了P450酶中的三个氨基酸位点（F387, F388和E73）对上方底物的选择性具有重要的调控作用。随后，通过对上述位点的突变改造，获得了四个突变体（F387A, F387G, F388N以及E73S），其可以识别并催化另外8个野生型酶不能识别的底物（cWLFL, cWLIL, cWLLL, 7Cl-cWLPL and 5/6/7/8F-cWLPL），生成12个底物自身二聚的吡咯并吲哚类生物碱（图1）。为了深入理解突变体的底物调控机制，联合课题组又解析了多个突变体的晶体结构，并通过分子动力学模拟（MD）分析阐明其动态调控机制，揭示了突变体F387G和E73S可分别通过减少空间位阻和调节底物通道来控制底物特异性。最后，通过将P450突变体转入至齿垢分枝杆菌，并交叉喂养两种不同的环二肽底物，实现了该类天然产物的集约式生物合成，产生了至少93种新结构交叉二聚的吡咯并吲哚生物碱产物。这部分工作不仅在获得的吡咯并吲哚生物碱数量上实现了大的飞跃（是此前已知的两倍之多），还为改造其他吡咯并吲哚P450偶联酶的底物选择性提供了重要思路，为后期深入探究该类天然产物的生物活性奠定了坚实的基础。

图 1. A）不同P450偶联酶的比对分析; B）偶联酶NasF5053 (PDB: 6VXV)的上方底物结合口袋中的关键氨基酸残基; C）获得的自身偶联的新结构吡咯并吲哚生物碱。

该研究工作受到了国家重点研发项目(2018YFC1706200，2020YFA0907700)，国家自然科学基金面上项目（31770063）以及上海市超级博士后激励计划（2019193）的支持。