《细胞》子刊：不吸烟为何会得肺癌？华西团队揭示吸烟者与不吸烟者肺腺癌免疫微环境差异

在东亚地区，有很多肺癌患者从不吸烟，而且以女性患者居多。

之前的研究显示，不吸烟者的肺癌和吸烟者的肺癌是不同的，如不吸烟者中EGFR、ERBB2、ALK和ROS1突变更常见，肿瘤突变负荷（TMB）水平更低等等，这些基因组上的不同也解释了不吸烟者的肺癌预后更好的原因。

不过，也有不少研究发现，不吸烟者的肺癌对抗PD-1/PD-L1免疫治疗反应较差，这提示，不吸烟者的肺癌肿瘤微环境可能与吸烟者的肺癌不同。对不吸烟者的肺癌肿瘤微环境的深入探究或可有助于这部分肺癌患者实现精准治疗。

近期，四川大学华西医院李为民/彭勇团队就利用单细胞测序，揭示了吸烟和从不吸烟的肺腺癌患者在肿瘤分子特征和肿瘤免疫微环境上的差异。

他们发现，吸烟者的肺癌和不吸烟者的肺癌微环境果然不一样，具体来说，对于吸烟者而言，吸烟诱导的肺泡功能障碍会提高肺腺癌的侵袭性；对于不吸烟患者而言，免疫抑制微环境是影响肺腺癌侵袭性的关键。

另外，他们还发现，免疫检查点CD47在不吸烟者的肺腺癌中存在高表达现象，或能作为不吸烟者的肺腺癌的理想治疗靶点。

研究发表在Cell Reports Medicine上。

论文首页截图

我们知道，吸烟是肺癌的危险因素，但在世界范围内，约有25%的肺癌患者一生中的吸烟量少于100支，这种肺癌又被称为不吸烟者肺癌。

不吸烟者的肺癌大多数为肺腺癌，但以往关于肺腺癌的样本多集中在吸烟者身上。

为了更好地了解吸烟者的肺腺癌与不吸烟者的肺腺癌在肿瘤免疫微环境上的差异，研究团队对22例肺腺癌患者（13例不吸烟者和9例吸烟者）的肿瘤标本及远端正常肺组织进行了单细胞RNA测序。

不吸烟者/吸烟者的肿瘤组织和正常肺组织用tNS/tS和nNS/nS表示。

对22例LUAD患者的单细胞测序

研究人员将165753个细胞分成了8种类型，分别为上皮细胞，免疫细胞（T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞和肥大细胞）和基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）。

整体上看，与正常肺组织相比，肿瘤组织中的NK细胞比例较低，B淋巴细胞的比例较高。且相比于tS，tNS中NK细胞的下降更为明显。研究人员推测，出现这一现象的原因可能是，从不吸烟者肺腺癌的肿瘤微环境不利于NK细胞向肿瘤靠近。

肺腺癌中，细胞分布情况

接下来，研究人员对正常肺组织和肿瘤组织的24965个上皮细胞进行了重新聚类。正常肺组织的上皮细胞被进一步分类为包括I型肺泡细胞（AT1），II型肺泡细胞（AT2）在内的5种亚型。

作为肺泡细胞的两个亚型，AT1细胞负责有效气体交换，AT2细胞可作为祖细胞，帮助肺泡进行更新和修复。

值得注意的是，正因为AT2细胞的这些特征，让其在各个类型的肺损伤中变得异常活跃，增加了癌变的风险。目前科学家们认为，肺腺癌其实就起源于AT2细胞。

因此，想要研究肺腺癌的特征，AT2细胞就是关键所在。在本研究中，研究人员确定了AT2相关的4个标记基因（如SFTPB、SFTPC、SFTPD和SFTA3），并比较了tNS、tS、nNS和nS中AT2相关标记基因的表达情况。

结果发现，在tS/nS组织中，AT2标记基因表达均低于tNS/nNS。这说明吸烟对肺上皮细胞造成了损伤。在此基础上，研究人员发现，AT2标记基因表达上调与较好的OS有关（P=0.0045），这也解释了从不吸烟者肺癌通常预后更好的原因。

随后，通过对癌细胞的基因富集分析，研究人员发现吸烟者和从不吸烟者的癌细胞呈现出不同的信号通路，其中吸烟者的癌细胞显示出了更多与细胞生长和迁移有关的生物学特性，这意味着，吸烟者的肺腺癌侵袭性更强。

基因富集分析

在对47580个髓系细胞进行了重新聚类后，研究人员根据基因表达不同将这些细胞归入到已知的细胞谱系中（如巨噬细胞谱系、单核细胞谱系，以及树突状细胞和中性粒细胞谱系）。

我们知道，巨噬细胞是肿瘤微环境中最重要的免疫细胞之一。因此，研究人员将重点落在了巨噬细胞谱系上。

一般来说，巨噬细胞谱系有两个分支，分别是组织驻留巨噬细胞群（TRM）和单核细胞来源的巨噬细胞群（MDM）。

然而在本研究中，研究人员发现了一个新的，具有混合特征的巨噬细胞亚群，Mixed_mac。Mixed_mac高表达细胞周期基因，TRM和MDM标记基因。

为了确定Mixed_mac的转录状态，研究人员对Mixed_mac进行了轨迹分析，进一步将Mixed_mac分成了倾向于高表达TRM标记基因（FABP4、MARCO、INHBA）的FABP4hi pro亚群和倾向于高表达一个MDM标记基因（SPP1）的SPP1hi pro亚群。也就是说，研究人员在本研究中定义了4个不同的巨噬细胞亚型。

巨噬细胞分类

对以上4个巨噬细胞群进一步分析显示，与正常肺组织相比，肿瘤组织中TRM较少，MDM的数量较多，而FABP4hi pro与TRM分布情况类似，SPP1hi pro与MDM在4种组织中的分布情况类似。

根据轨迹分析结果、骨髓细胞的UMAP图以及4种巨噬细胞的分布情况，研究人员发现，FABP4hi pro可以产生新的TRM，同样地，研究人员推测SPP1hi pro也可以产生MDM。

不过，既往研究显示，只有单核细胞能产生MDM。为了验证以上推测，研究人员对MDM、单核细胞、SPP1hi pro进行了轨迹分析，结果证实了，SPP1hi pro是除单细胞以外另一个重要的MDM来源。

轨迹分析

由于SPP1hi pro多集中在肿瘤组织中，尤其是在从不吸烟者的肺腺癌肿瘤组织中。因此，研究人员认为，SPP1hi pro产生的MDM促进了不吸烟者的肺腺癌的进展。

因为巨噬细胞本身具有可塑性，可分化成抑制肿瘤生长的M1型巨噬细胞和促进肿瘤进展的M2型巨噬细胞。

在本研究中，研究人员对M1和M2型巨噬细胞相关基因进行标记后发现，与正常组织相比，肿瘤组织中TRM和MDM均表现出M1型巨噬细胞标记基因表达下调，M2型巨噬细胞标记基因表达上调的现象，这说明在肺腺癌的肿瘤微环境中，TRM和MDM具有免疫抑制特性。

此外，研究人员还发现，与tS相比，tNS中M2型巨噬细胞标记基因表达上调的现象更明显，这说明从不吸烟者的肺腺癌免疫微环境中，TRM和MDM发挥了更强的免疫抑制作用。

由于不吸烟者肺腺癌对抗PD-L1/PD-1治疗不敏感，因此，找到一个合适且理想的免疫检查点很有必要。

于是，研究人员检查了不同细胞类型中免疫检查点的表达，结果发现，与PD-L1相比，CD47在癌细胞上的表达要高得多，同时CD47配体SIRPA在巨噬细胞亚群中也出现了高表达现象。更重要的是，与吸烟者相比，从不吸烟者的肺腺癌中的癌细胞有更高的CD47表达。

靶点筛选

癌细胞中MHC-I分子表达较低的肿瘤对抗CD47治疗更敏感，研究人员比较了tNS和tS之间MHC-I分子的表达。结果发现，tNS的MHC-I分子表达更低，这意味着从不吸烟者的肺腺癌更容易从抗CD47免疫治疗中获益。

总的来说，该研究为我们提供了关于癌细胞和免疫细胞多样性的深入认识，以及在单细胞层面上，不吸烟者的肺腺癌和吸烟者的肺腺癌在肿瘤免疫微环境上的差异。