利用荧光显微镜高通量测定微生物出生及死亡速度
来源：生物谷 2019-06-11 10:16
微生物通常生长在营养浓度有波动的环境中，定量研究微生物在这些环境下的适应性（净生长速度）对理解微生物的进化及生态至关重要。 通常测定微生物生长速度的方法有两种：即光密度测定法和流式细胞仪测定法。由于光密度测定法不能区分活细胞和死细胞的浓度，流式细胞仪法虽然可以区分死细胞和活细胞，但其操作比较复杂。
微生物通常生长在营养浓度有波动的环境中，定量研究微生物在这些环境下的适应性（净生长速度）对理解微生物的进化及生态至关重要。
通常测定微生物生长速度的方法有两种：即光密度测定法和流式细胞仪测定法。由于光密度测定法不能区分活细胞和死细胞的浓度，流式细胞仪法虽然可以区分死细胞和活细胞，但其操作比较复杂。最近，由美国Fred Hutchinson Cancer Research Center的 教授团队在Quantitative Biology上发表了题为“High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy”文章（点击下载PDF全文）。该文详细介绍了如何利用荧光显微镜技术定量研究微生物的生长及死亡速度。
通常测定微生物生长速度的方法有两种：即光密度测定法和流式细胞仪测定法。由于光密度测定法不能区分活细胞和死细胞的浓度，流式细胞仪法虽然可以区分死细胞和活细胞，但其操作比较复杂。最近，由美国Fred Hutchinson Cancer Research Center的 教授团队在Quantitative Biology上发表了题为“High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy”文章（点击下载PDF全文）。该文详细介绍了如何利用荧光显微镜技术定量研究微生物的生长及死亡速度。
文章概要
为了能够自动测定荧光酵母的生长及死亡速度，作者首先对荧光显微镜进行了设置（如图1），即对常规的荧光显微镜补加一些附件。恒温罩（Enclosure）保持细胞样品温度，自动移动的平台（Motorized stage）可以重复对很多样品用明场和荧光进行拍照，自动转换的滤片（Motorized filter cubes）可以自动进行滤片切换，ITO Lid warmer（热盖玻璃）则避免了拍照过程中水蒸气在盖子上的凝结。此外，作者还专门写了一个“LabVIEW”程序，该程序可以自动在明场对焦，然后转到荧光下对酵母进行拍照，从而减少光毒性对微生物生长的影响。
图1. 荧光显微镜的设置
通过上述荧光显微镜的设置，作者对lys2-和ade8-这两种酵母的生长及死亡速率进行了测定，并比较了不同测定方法的结果。lys2-和ade8-是两种分别需要Lys（赖氨酸）和Ade（腺嘌呤）才能成长酵母突变体。结果表明，lys2-和ade8-分别在缺乏Lys和Ade的培养基中生长时，其死亡速度均呈现出时间依赖性；并且它们的死亡速度分别与Lys和Ade的浓度有关（如图2）。此外，荧光显微镜自动检测法与手动检测法及流式细胞仪检测法相比，其结果与后两种的检测结果基本一致（如图2）。
图2. lys2-和ade8-的死亡率具有时间和营养物浓度依赖性
另外，作者发现极低浓度的营养可能不会被微生物消耗，并且低浓度营养物会导致不同菌株以不同的速度死亡和出生（如图3）。其原因可能是菌株没有在低浓度营养物培养的条件下进化过，因此不同基因型产生不同的生长速度。
图3. 低浓度营养物培养条件下lys2-和ade8-的出生及死亡速率
此外，在描述lys2-和ade8-的细胞生长速度时，作者发现Moser（S-型）模型要优于Monod模型。
最后，作者希望通过这种高通量荧光显微镜定量测定法，能为今后荧光微生物生长的测定提供一种简单，快速，准确的方法。目前，该方法已被成功用于测定原始和进化菌种的生长速度，相关成果发表在eLife中（https://elifesciences.org/articles/44812）。
Reference
1. Hart, S.F.M., Skelding, D., Waite, A.J. et al. (2019) High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy. Quant Biol 7: 69.
2. Hart, S.F.M., Pineda, J.M.B., Chen, Chi-Chun, Green, R. and Shou, W. (2019) Disentangling strictly self-serving mutations from win-win mutations in a mutualistic microbial community. eLife 8: 44812
为了能够自动测定荧光酵母的生长及死亡速度，作者首先对荧光显微镜进行了设置（如图1），即对常规的荧光显微镜补加一些附件。恒温罩（Enclosure）保持细胞样品温度，自动移动的平台（Motorized stage）可以重复对很多样品用明场和荧光进行拍照，自动转换的滤片（Motorized filter cubes）可以自动进行滤片切换，ITO Lid warmer（热盖玻璃）则避免了拍照过程中水蒸气在盖子上的凝结。此外，作者还专门写了一个“LabVIEW”程序，该程序可以自动在明场对焦，然后转到荧光下对酵母进行拍照，从而减少光毒性对微生物生长的影响。
图1. 荧光显微镜的设置
通过上述荧光显微镜的设置，作者对lys2-和ade8-这两种酵母的生长及死亡速率进行了测定，并比较了不同测定方法的结果。lys2-和ade8-是两种分别需要Lys（赖氨酸）和Ade（腺嘌呤）才能成长酵母突变体。结果表明，lys2-和ade8-分别在缺乏Lys和Ade的培养基中生长时，其死亡速度均呈现出时间依赖性；并且它们的死亡速度分别与Lys和Ade的浓度有关（如图2）。此外，荧光显微镜自动检测法与手动检测法及流式细胞仪检测法相比，其结果与后两种的检测结果基本一致（如图2）。
图2. lys2-和ade8-的死亡率具有时间和营养物浓度依赖性
另外，作者发现极低浓度的营养可能不会被微生物消耗，并且低浓度营养物会导致不同菌株以不同的速度死亡和出生（如图3）。其原因可能是菌株没有在低浓度营养物培养的条件下进化过，因此不同基因型产生不同的生长速度。
图3. 低浓度营养物培养条件下lys2-和ade8-的出生及死亡速率
此外，在描述lys2-和ade8-的细胞生长速度时，作者发现Moser（S-型）模型要优于Monod模型。
最后，作者希望通过这种高通量荧光显微镜定量测定法，能为今后荧光微生物生长的测定提供一种简单，快速，准确的方法。目前，该方法已被成功用于测定原始和进化菌种的生长速度，相关成果发表在eLife中（https://elifesciences.org/articles/44812）。
Reference
1. Hart, S.F.M., Skelding, D., Waite, A.J. et al. (2019) High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy. Quant Biol 7: 69.
2. Hart, S.F.M., Pineda, J.M.B., Chen, Chi-Chun, Green, R. and Shou, W. (2019) Disentangling strictly self-serving mutations from win-win mutations in a mutualistic microbial community. eLife 8: 44812
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