eLife：利用CRISPR-Cas9进行起始密码子中断有望治疗富克斯角膜营养不良

2021年8月9日讯/生物谷BIOON/---在一项新的研究中，来自美国俄勒冈大学、弗吉尼亚大学、犹他大学、马萨诸塞大学医学院和约翰霍普金斯大学的研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑技术中断起始密码子，以阻止小鼠的富克斯角膜营养不良（Fuchs' corneal dystrophy）。这是首次证明使用这种称为起始密码子中断（start codon disruption）的技术来治疗有丝分裂后组织所患的遗传疾病，并有潜力通过取代角膜移植的需求而引发富克斯角膜营养不良治疗变革。它还可能导致针对其他遗传疾病甚至影响非生殖细胞的疾病的新疗法。相关研究结果近期发表在eLife期刊上，论文标题为“Start codon disruption with CRISPR/Cas9 prevents murine Fuchs’ endothelial corneal dystrophy”。论文通讯作者为俄勒冈大学的Balamurali Ambati教授。

这篇论文详细介绍了一项为期8年的研究，该研究涉及一种在全球的发病率大约为1/2000的疾病。富克斯角膜营养不良导致角膜内皮细胞死亡，引起肿胀，从而可导致视力下降、疼痛、视力障碍和失明。

Ambati说，“有很多人在努力阻止这些细胞死亡，但最终的挑战是，它们是有丝分裂后的细胞---你生来就有这些细胞，当它们开始死亡时，就成了问题。”

目前，治疗富克斯角膜营养不良的唯一方法是角膜移植，这是一项重大手术，有相关风险和许多潜在的并发症，如感染、排斥和青光眼。在美国，这种疾病是角膜移植的主要原因，尽管角膜组织在美国很容易获得，但在世界大部分地区却很短缺。

这些作者将注意力集中在这种疾病的早发亚型上，这种疾病亚型通常发生在30岁左右或40岁出头的患者。他们着重关注一种称为COL8A2（collagen type VIII alpha 2 chain）的胶原蛋白的单点突变上。

Ambati说，“之前已证实，如果你敲除这个基因（COL8A2），角膜就会变得很好。具体来说，是这种蛋白质的突变形式导致了这种问题。”

这些作者试图测试敲除该蛋白是否能够为这种疾病提供一种新的治疗策略。他们利用CRISPR-Cas9基因编辑靶向成年突变小鼠体内的这种致病蛋白，但面临着将该技术用于有丝分裂后细胞的挑战。

论文第一作者、Ambati实验室研究员Hironori Uehara说，“对于有丝分裂后的细胞，诱导同源重组是非常困难或不可能的。因此，我们必须想出其他办法来实现我们的目标。”

Uehara开发了一种创新手段，通过靶向COL8A2基因的起始密码子来阻断它的表达。起始密码子是蛋白质合成的起始位点。破坏起始密码子可导致蛋白质表达的终止。靶向其他位点也可以通过移码终止蛋白质的表达，但它可能诱发其他不需要的蛋白质表达。位于起始密码子下游越远的密码子，发生错义突变的风险越大，有可能产生活性未知的突变蛋白。

Ambati说，“我们确定，我们可以破坏起始密码子，从而通过向角膜提供基因疗法，有选择地抑制这种蛋白质的表达。”

这些作者通过将编码酿脓链球菌Cas9（SpCas9）和向导RNA（gRNA）的腺病毒注射到直接面对角膜内皮细胞的小鼠眼睛前房进行治疗。在检查这种治疗的安全性的研究中，他们确定周围组织没有受到基因治疗的影响。他们研究了其他的非靶基因，以确保它们没有受到影响，并确定最大耐受剂量对视网膜、虹膜和眼睛的其他部分是安全的。

图片来自Pixabay/CC0 Public Domain。

这些作者发现，他们的方法不仅可以保留角膜内皮细胞的密度和结构，而且还可以拯救它们的功能。在诱发肿胀的功能拯救试验中，他们对角膜有了一些令人惊讶的发现。在角膜上加水并没有像科学家们预期的那样诱发肿胀。相反，他们确定肿胀是由眼房水通过角膜内皮（角膜的背面）进入角膜而诱发的，因此，在摘除上皮后角膜表面的高渗溶液挑战导致了最大的角膜肿胀。

这些作者使用了由约翰霍普金斯大学威尔默眼科研究所的Albert Jun博士培育的小鼠，这些小鼠携带的突变与导致人类富克斯角膜营养不良的突变相同。

这项研究为未来在动物和非人类灵长类动物中使用COL8A2基因敲除治疗富克斯角膜营养不良的可行性研究并最终在涉及人类的临床试验中使用奠定了基础。Ambati说，减少富克斯角膜营养不良患者对角膜移植的需求可以间接帮助其他需要角膜组织的患者。未来的研究还可以探索Cas9介导的基因敲除对携带单点突变的有丝分裂后细胞的其他遗传疾病的影响，包括神经系统疾病、免疫疾病和影响关节的某些疾病。

Ambati说，“它有可能将CRISPR-Cas系统的治疗目标扩大到不具备细胞分裂能力的组织。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Hironori Uehara et al. Start codon disruption with CRISPR/Cas9 prevents murine Fuchs' endothelial corneal dystrophy. eLife, 2021, doi:10.7554/eLife.55637.