Science：新研究揭示Ctf18-RFC装载PCNA用于前导链DNA合成的机制

DNA聚合酶（Pol），如前导链Pol（Polε）和滞后链Pol（Polδ），在全酶背景下与增殖细胞核抗原（PCNA）DNA滑动夹一起发挥活性和加工能力。PCNA夹是一个封闭的环，需要通过使用ATP的夹装载因子在DNA周围打开和关闭。一般认为，前导链和滞后链 DNA 上的 PCNA 都是由复制因子 C（RFC）装载的，其中RFC 是由 Rfc1 至 Rfc5 组成的五聚体 ATP 酶复合物。不过，近期的研究表明，另一种夹装载因子 Ctf18-RFC 可能负责将 PCNA 加载到前导链上。Ctf18-RFC 与 RFC共享四个亚基（Rfc2 至 Rfc5），但用 Ctf18 取代了 Rfc1，并包括另外两个亚基：Ctf8 和 Dcc1。前导链为什么需要不同的夹装载因子一直是个谜。

在一项新的研究中，来自洛克菲勒大学和文安德研究所的研究人员试图了解为什么在芽殖的酿酒酵母中，前导链 PCNA 要由 Ctf18-RFC装载。由于 Polδ 是在 PCNA装载后被 PCNA 募集到 DNA 上的，而 Polε 则是在复制起点激活过程中作为复制螺旋酶组装过程的一部分被募集到 DNA 上的（在 PCNA装载之前），因此他们假设在 S 期期间，引物的 3′端暴露在滞后链上，可被 RFC 使用，但在前导链上，引物的 3′端可能因距离较近而已被前导链上的 Polε 结合，因此需要专用的前导链夹装载因子。

基于此，他们将纯化的蛋白成分 Ctf18-RFC、PCNA 和 Polε 的催化核心（Polε-core）与模板-引物 DNA 底物在 ATPγS 和脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs）存在或不存在的条件下进行体外混合，然后通过低温电镜（cryo-EM）和相关的二维、三维分类及三维重建探究了由此产生的反应产物。

相关研究结果发表在2024年8月2日的Science期刊上，论文标题为“Mechanism of PCNA loading by Ctf18-RFC for leading-strand DNA synthesis”。

研究者通过低温电镜和生化实验发现，Ctf18-RFC 不需要 Polε 的帮助，也能将 PCNA装载到引物 3′端的 DNA 底物上。意想不到的是，低温电镜结构显示Ctf18 亚基的AAA+结构域具有内在的移动性，这与所有其他夹装载因子都不同。由于这个最大亚基的 AAA+结构域通常为PCNA提供最大的结合表面以打开PCNA夹，因此 Ctf18 AAA+结构域的可移动性可能是其装载 PCNA 效率低的原因。这一特征可能是为了防止 Ctf18-RFC 与 RFC 竞争，将 PCNA装载到引物 3′端容易接触到的滞后链上。

其次，Ctf18-RFC 的装载活性是通过与 Polε 结合来促进的，这表明其特异性是针对前导链进化而来的。第三，Ctf18-RFC 的 Ctf8 和 Dcc1 成分以及 Ctf18羧基端肽形成了钩状结构，可与 Polε 结合并降低 Polε催化结构域与 DNA 结合的亲和力。这可能是将 DNA 从 Polε横向转移到 Ctf18-RFC-PCNA 的先决条件，也可能解释为什么 Ctf18-RFC 进化出了这种特异的钩状结构，以应对 Polε 屏蔽引物 3′端的情况。

第四，在Polε存在的情况下，研究者捕获了两种装载中间产物：一种是DNA在转移到Ctf18-RFC-PCNA之前位于Polε内，另一种是DNA离开Polε并转移到Ctf18-RFC-PCNA。这两种中间产物揭示了 Polε 中的一些特征，比如 P-结构域和氨基端长螺旋能特异性地稳定原本灵活的 Ctf18 AAA+结构域，从而加速 Ctf18-RFC 的装载活性。最后，移除 Polε 和 Ctf18 中这些相互作用的结构元件，就会取消 Polε 对 Ctf18-RFC装载活性的刺激。

通过Ctf18-RFC将Polε依赖性的PCNA装载到前导链DNA上的模型

图片来自Science, 2024, doi:10.1126/science.adk5901

通过解析出一系列与 PCNA、DNA 和Polε-core结合的 Ctf18-RFC 的低温电镜结构，研究者揭示了 Ctf18-RFC 和 Polε 都进化出了相互作用的特殊功能，从而将引物的3′端从 Polε 转移到 Ctf18-RFC，使 PCNA装载到前导链上。这一观察结果解释了为什么真核细胞进化出了专门用于装载 PCNA 的 Ctf18-RFC，以促进 Polε 合成前导链。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

Zuanning Yuan et al. Mechanism of PCNA loading by Ctf18-RFC for leading-strand DNA synthesis. Science, 2024, doi:10.1126/science.adk5901.