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张锋最新论文:CRISPR-Cas9的祖先IscB-ωRNA的结构和功能机制

来源:生物世界 2022-11-10 15:17

对IsrB及其ωRNA的结构分析,阐明了IsrB-ωRNA是如何共同识别并切割靶DNA的,也为进一步开发和工程化改造这一小型化核酸酶提供了基础。与其他RNA导向的系统的比较,突出了蛋白质和RNA之间的
在过去十年里,基于CRISPR的基因编辑技术得到了快速发展,并被成功应用放到了人体临床试验中已治疗遗传疾病和癌症。与此同时,全世界的科学家们也在不断挖掘新的具有基因编辑潜力的新工具,以解决现有基因编辑工具尺寸太大、脱靶性等问题。
2021年9月,张锋团队在 Science 期刊发表论文【1】,发现了一类广泛的转座子编码的RNA引导核酸酶,并将其命名为OMEGA系统(包括IscB、IsrB、Tnp8)。其中IscB可能是Cas9的祖先。
该研究还发现,OMEGA系统使用一段RNA来指导切割DNA双链,即ωRNA。更重要的是,这些核酸酶很小,仅为Cas9的大约30%,这意味着它们可能更容易被递送到细胞中。
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对于OMEGA系统,张锋曾表示,对这些广泛存在的可编程核酸酶的发现感到非常兴奋,原来它们一直隐藏在我们鼻子底下。这些发现也提示了我们,还有更多的可编程核酸酶等待着发现和进一步开发。
2022年11月7日,张锋Hiroshi Nishimasu 等人在 Nature Communications 期刊发表了题为:Structure of the IscB–ωRNA ribonucleoprotein complex, the likely ancestor of CRISPR-Cas9 的研究论文【2】
该研究解析了IscB蛋白和和靶DNA的复合物的冷冻电镜结构,揭示了IscB -ωRNA核糖核蛋白复合体(RNP)的详细结构,从而展示了如此小的IscB蛋白是如何与ωRNA组装并介导RNA引导的DNA切割作用。
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具体来说,IscB蛋白尺寸很小,约400个氨基酸,而Cas9通常在1000-1400个氨基酸,这么小的IscB蛋白是如何与ωRNA组装并介导RNA引导的DNA切割作用的呢?
通过冷冻电镜结构解析发现,IscB蛋与Cas9具有相同的RucV和HNH内切酶结构域,而缺少了α-螺旋识别结构域(REC)。IscB与1个约200-400nt的非编码RNA(ωRNA)结合,从而实现对特定DNA序列的识别靶向和切割,其ωRNA要比Cas9的约100nt的向导RNA大得多。
这种比较大的ωRNA骨架在结构和功能上补偿了IscB相对于Cas9所缺少的α-螺旋识别结构域(REC),并参与向导RNA对靶标DNA的识别,由于IscB保留了与Cas9相同的RucV和HNH内切酶结构域,因此,可以实现对靶标DNA的切割。
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IscB-ωRNA-靶标DNA复合体的整体结构
这一发现为IscB-ωRNA复合物的DNA切割机制以及CRISPR-Cas9系统的进化提供了深刻的见解
值得一提的是,张锋Hiroshi Nishimasu 两人在11月3日,各自在 Science 期刊发表了解析Cas7-11的结构和作用机制的研究论文【3、4】。详情:Science:Cas7-11,一种可以切割蛋白质的CRISPR-Cas系统
2022年5月,美国康奈尔大学可爱龙实验室在 Science 期刊发表论文【5】解析了OMEGA系统中的IscB-ωRNA的结构及其切割DNA的机制。
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2022年10月12日,张锋团队在 Nature 期刊发表了题为:Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA 的研究论文【2】
该研究解析了OMEGA系统中的IsrB-ωRNA和靶DNA的复合物的冷冻电镜结构。IsrB是IscB的缺少HNH核酸酶结构域的同系物,因此尺寸更小,仅有约350个氨基酸,这些系统结构的解析阐明了IsrB-ωRNA是如何共同识别并切割靶DNA的,也为进一步开发和工程化改造这一小型化核酸酶提供了基础。
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RNA引导的IsrB是转座子IS200/IS605超家族编码的OMEGA家族成员,从系统发育分析和共享的独特结构域来看,IscB是Cas9的祖先,而IsrB很可能是IscB的前身。
与IscB和Cas9相比,IsrB缺少HNH内切酶结构域、α-螺旋识别结构域(REC)和大部分PAM序列相互作用域,因此,IsrB(仅约为350个氨基酸)要比Cas9(约1000-1400个氨基酸)小得多,也比IscB(约400个氨基酸)小。然而,IsrB较小的体积被一个相对较大的向导RNA所平衡(其ωRNA长约300nt)
 
张锋团队解析了来自湿热厌氧菌 Desulfovirgula thermocuniculi 的IsrB(DtIsrB)及其ωRNA和靶DNA的复合物的冷冻电镜结构。结构解析显示,IsrB蛋白的整体结构与Cas9蛋白共享一个骨架结构。
但不同的是,Cas9使用α-螺旋识别结构域(REC)来促进对靶标的识别,而IsrB则依赖于它的ωRNA,ωRNA的一部分形成了一个复杂的三维结构,起到了类似于REC的作用。
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IsrB-ωRNA-靶标DNA复合体结构
为了更好地理解IsrB和Cas9从RuvC进化过程中的结构变化,张锋团队比较了来自嗜热栖热菌Thermus thermophilusRuvC(TtRuvC)IsrBCjCas9SpCas9的与靶DNA结合的结构。
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RuvC-IsrB-Cas9的结构进化
对IsrB及其ωRNA的结构分析,阐明了IsrB-ωRNA是如何共同识别并切割靶DNA的,也为进一步开发和工程化改造这一小型化核酸酶提供了基础。与其他RNA导向的系统的比较,突出了蛋白质和RNA之间的功能相互作用,促进了我们对这些不同系统的生物学和进化的理解。

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