microRNA表达的活细胞成像与转录后反馈控制

microrna (mirna)是真核细胞中调控复杂基因表达网络的小型非编码rna。由于其独特的表达模式，mirna是特定细胞状态的潜在分子标记物。虽然需要一个能够在活细胞中成像miRNA的系统来直观地检测miRNA的表达，但很少有响应靶miRNA表达的荧光信号传感器(miron传感器)可用。

在这里，作者报道了一个包含双向启动子驱动的Csy4核糖核酸内切酶和绿色荧光蛋白ZsGreen1的miron传感器，用于转录后反馈控制的miRNAs活细胞成像。Csy4 辅助的 miR-ON (Csy4-miR-ON) 传感器产生的背景可以忽略不计，但对目标 miRNA 反应灵敏，允许在各种人类细胞中对 miRNA 进行高对比度荧光检测。作者发现，Csy4-miRON传感器能够在体外和体内对各种mirna进行成像，包括miR-21、miR-302a和miR-133。这个强大的工具可以用来评估miRNA表达在不同的生物和医学应用。

图片来源：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.08.018.

microrna (mirna)是一类调节基因表达的非编码小rna。不同类型的细胞表现出独特的miRNA表达模式，在分化、肿瘤发生和病毒感染等物理和病理过程中动态变化。miRNA表达异常与广泛的人类疾病的发病和进展密切相关; 因此，mirna是潜在的治疗和诊断靶点。针对参与肿瘤进展或抑制的 miRNA 的策略已被广泛探索用于癌症治疗。此外，一些mirna在特定的细胞类型中高度表达，在许多情况下，直接参与决定细胞命运。因此，这些mirna可以作为明确的分子标记，从异质细胞群中分离出特定的细胞。

miRNA表达的研究可以揭示miRNA的功能，并用于评估细胞状态。Northern blot、微阵列、定量逆转录酶PCR和最近的RNA测序已被广泛用作分析mirna表达的标准技术。然而，这些方法与细胞裂解相关，因此不适合检测活细胞中miRNA表达的动态变化。此外，由此产生的大量miRNA群体不太可能适合单细胞分析。相比之下，基于荧光或生物发光成像的无创技术在实时分析miRNA表达方面非常有利。

此前，作者和其他人已经报道了含有荧光报告基因的miRNA传感器系统，该基因含有多个互补序列，针对其3 '非翻译区(UTR)感兴趣的miRNA。在这些系统中，靶miRNA与其互补序列的结合会导致报告基因编码mrna的降解，导致报告基因活性降低。这种类型的miRNA传感器(miroff传感器)通过监测荧光强度下降的程度，可以实时、长期跟踪活细胞中miRNA的表达。miroff传感器已经成功地用于分析培养细胞和动物中的mirna。

尽管 miR-OFF 传感器具有显着的效力，但由于 miRNA 活性检测的模式，很难区分由 miRNA 表达以外的原因引起的假阳性； 即荧光消失。重要的是，驱动报告基因表达的启动子活性取决于细胞类型、基因组背景和表观遗传控制; 在某些情况下，如长期细胞培养或细胞分化，启动子活性降低或丧失是可能的。为了降低误报的风险，需要一种miRNA表达时产生荧光的miRNA传感器(miron传感器)。特别是，基因编码的基于荧光的miron传感器在培养细胞和动物中miRNA表达的活细胞成像方面具有优势。此外，这些miron传感器可能适用于长期的miRNA检测。

因此，miron传感器应该能够对肿瘤发生等发病过程中的miRNA表达进行可靠的评估，使其成为非侵袭性诊断的潜在工具。此外，这些传感器可用于分离体外分化和细胞重编程后表达组织特异性mirna的细胞，为细胞治疗和再生医学制备细胞来源。然而，一些固有的困难，包括准确的开关和适当的信噪比增益，是设计一个有效的miRON系统能够敏感地检测miRNA表达的挑战。

csy4 - miron传感器的设计。

图片来源：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.08.018.

在本研究中，作者报道了一个基于miRNA-responsive Csy4转录后反馈控制的miron系统。Csy4是一种核糖核酸内切酶，负责处理来自铜绿假单胞菌中聚集的规律性间隔短回语重复序列(CRISPRs)的前体转录本。CRISPR系统通过使用与外源核酸互补的CRISPR相关(Cas)蛋白和CRISPR RNA复合物，在消除原核生物中的入侵寄生虫方面发挥着核心作用。

Csy4 特异性识别保守茎环的 28 nt 序列，然后切割茎碱基的 3' 末端。Csy4已被广泛应用于rna -蛋白结合分析、可编程基因网络设计、基因组编辑等生物学领域。作者设计了一个Csy4辅助miron (Csy4- miron)传感器，包含Csy4基因和一个由双向启动子驱动的荧光报告蛋白ZsGreen1 (ZsG)。

csy4 - miron传感器可用于在体内和体外成像miRNA表达。重要的是，这种传感器产生了固有的低背景，允许高对比度的荧光成像。作者提供了一个宝贵的工具miRNA分析和评估细胞状态在不同的生物学和医学研究。（生物谷 Bioon.com）

参考文献

Masayuki Sano et al. Live-cell imaging of microRNA expression with post-transcriptional feedback control. Mol Ther Nucleic Acids 2021 Aug 26;26:547-556. doi: 10.1016/j.omtn.2021.08.018.