Nature子刊：中科院深圳先进院戴卓君团队开发“活”塑料，利用合成生物学助力塑料降解
来源：生物世界 2024-09-01 14:13
塑料的发明为我们的日常生活带来了极大的便利。但是，大规模塑料垃圾的产生以及不当的处理方式，使得塑料垃圾（白色污染）成为当下最为严峻的环境问题之一。
中国科学院深圳先进技术研究院戴卓君课题组在 Nature 子刊 Nature Chemical Biology 上发表了题为：Degradable living plastics programmed by engineered spores 的研究论文。
该研究通过对微生物进行基因编辑并产生具备极端环境耐受能力的孢子，使其可以在特定条件下分泌塑料降解酶；并通过塑料加工方法（高温、高压或有机溶剂）将孢子包埋在塑料基质中。
日常使用环境中，孢子保持休眠状态，塑料也可保持稳定的使用性能。在特定条件下（表面侵蚀、堆肥），塑料中的孢子被激活并启动降解程序，完成塑料的完全降解（图1）。
图1. 整体研究思路
塑料的发明为我们的日常生活带来了极大的便利。但是，大规模塑料垃圾的产生以及不当的处理方式，使得塑料垃圾（白色污染）成为当下最为严峻的环境问题之一。2016年，Yoshida等人报道了土壤细菌Ideonella sakaiensis，该菌株生长在日本一个塑料回收设施附近受PET污染的沉积物中。这种革兰氏阴性、需氧、杆状的细菌具有非凡的能力，能够通过表达两个关键酶：PETase及MHETase，从而利用PET作为其生长所需要的主要碳源。在之后的一系列研究中，大量合成生物学领域的工作围绕着塑料降解相关酶的挖掘、设计、进化及改造开展，但鲜有工作关注可降解塑料的合成方法创新。
2018年及2021年，具有高分子物理背景的Ting Xu课题组（加州大学伯克利分校）先后在 Science 和 Nature 发表了两篇文章，从另一个视角和维度推进了可降解塑料的研发。在2018年的 Science 论文中，研究团队开发出一种由四种单体合成的聚合物（RHPs，random heteropolymers），每种单体亚单位能与目标蛋白表面上的化学片段相互作用。这些单体亚单位相互连接模拟天然蛋白，从而使得它们与蛋白表面之间的相互作用的灵活性实现最大化，这种基于相互作用的理性设计使蛋白质在无细胞合成中进行正确折叠，并保持水溶性蛋白质在有机溶剂中的活性。在这个工作的基础上，Ting Xu的团队将塑料降解酶，RHPs与塑料母粒（聚己内酯，PCL）进行混合加工，RHPs保护了水解酶在苛刻的塑料加工环境中的生物学功能。在无水环境下塑料可以稳定使用，而在有水环境或堆肥条件下可以迅速降解（Nature, 2021）。
将降解酶预置在塑料里需要平衡加工过程中的极端环境与酶的稳定性。尽管Ting Xu团队的精彩工作提出了通过RHPs调节蛋白质稳定性这一确定方案，但是该方法的推广仍有诸多挑战。首先RHPs的合成难度高，即使对于具有一般化学合成背景的实验室也并非易事；其次，PCL加工温度（80-120摄氏度）在塑料家族中几乎是最低的，常见的塑料加工温度大多大于200摄氏度，其中PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）的加工温度更高达300摄氏度，RHPs的保护能力在这些体系中存在巨大挑战。
沉睡的孢子与活塑料
在自然亿万年的演化下，诸多微生物进化出了针对恶劣环境条件的抵抗力。当极端环境到来，不再适合生存和繁殖的时候，细菌就会转变成孢子的形式。这种转变可以让细菌获得超强的抵御能力。孢子可以忍受极端的干燥、温度和压力，而这些极端环境恰好存在于塑料加工的环境中。
由此，研究团队提出通过合成生物学方法改造枯草芽孢杆菌，将可控分泌塑料降解酶（洋葱霍尔德菌脂肪酶，Lipase BC）的基因线路导入枯草芽孢杆菌，并在二价锰离子的胁迫环境中，迫使枯草芽孢杆菌“休眠”，形成孢子形态。产生的孢子同样带有编辑的基因线路，并且相比于细菌还具备了针对高温、高压、有机溶剂和干燥的耐受性。研究团队通过将工程化改造的孢子溶液与PCL塑料母粒直接混合，通过高温熔融挤出或者有机溶剂方法制备了一系列含有孢子的塑料。在物理性能方面的各项测试中，研究团队发现活塑料与PCL普通塑料，在屈服强度、应力极限、最大形变量和熔点等参数上均没有显著区别。日常使用环境中, 孢子保持休眠状态，塑料也可保持稳定的使用性能（图2）。
图2. 普通PCL塑料和“活”塑料的宏观和微观照片
孢子的释放及降解过程的启动
塑料降解的第一步，是需要将活体塑料内部的孢子成功释放并重新复苏生长。研究团队首先尝试了两种孢子释放的方式。一种方法是利用南极假丝酵母脂肪酶B（Lipase CA）对塑料表面进行侵蚀。Lipase CA对PCL塑料的水解作用是一种“剪刀”形式（图3），在宏观上表现为对PCL塑料的外部破碎作用。在Lipase CA的作用下，PCL表面被破坏，包埋在材料内部的工程化孢子被释放到外界环境中，并开始复苏生长，启动Lipase BC的表达。Lipase BC会与PCL高分子链末端结合，进而将PCL分子链一步步完全降解（最终降解分子量<500 g/mol）。结果表明，活体塑料可以在6-7天内迅速降解，而只有表面破坏（Lipase CA）作用的普通PCL塑料即使在21天后，也有大量的塑料碎片存在（图4）。
图3. 两种酶对PCL塑料的降解机理示意图
图4. 两种酶对PCL塑料，降解前后的表面结构和分子量变化。(a) CA酶处理普通PCL塑料（左）和活体功能塑料（右）的降解效果；(b) 活PCL降解过程中分子量变化曲线；(c) 仅CA酶对普通PCL塑料降解过程中分子量变化曲线
另一种孢子释放的方法是堆肥，在不需要任何其他外源制剂的加入下，土壤环境中活塑料能够在25-30天以内就可被完全降解。而传统PCL塑料则需要55天左右才能被降解至肉眼不可见（图5）。
图5. “活”塑料在土壤条件下的堆埋降解。(a)活体塑料在土壤环境中降解；(b) 普通PCL塑料在土壤环境中降解
不止于此
前面提到，在塑料家族中，PCL的加工条件实际较为”温和“，该研究中选择PCL体系更多是由于其高效的酶降解系统基础：Lipase BC作为一种processive enzyme可以捕捉PCL链进行完全降解。因此为了验证系统的普适性，研究团队继续尝试了其他的塑料体系，将带有绿色荧光质粒的孢子分别与PBS（聚丁二酸丁二醇酯）, PBAT（聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯）, PLA（聚乳酸），PHA（聚羟基脂肪酸酯）甚至PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）进行混合加工，其中PET的加工温度高达300摄氏度，之后我们通过物理研磨的方法对孢子进行了释放。有趣的是，即使从PET塑料中释放出来的孢子依旧可以复苏并重新表达绿色荧光。这也为制作其他基底的活塑料奠定了良好的基础（图6）。
图6. 其他基底“活”塑料。(a)其他塑料种类及其加工温度；(b) 热熔制备多种基底的“活”塑料；(c) 物理破碎塑料，释放并激活携带绿色荧光蛋白的孢子；(d) 研磨破碎“活”塑料；(e) 工程化孢子成功释放并表达绿色荧光蛋白
为了验证系统的放大可能，研究团队还使用单螺杆挤出机进行了小规模工业化测试，经过上述方法得到的活体的PCL塑料，依然具有快速高效的降解效率（图7）。并且，研究人员还将活体塑料置于雪碧环境中浸泡2个月，在没有外界作用的情况下，活体塑料能够保持稳定的外形，说明活体塑料能够像传统塑料一样使用，只有在它们被破坏或被废弃的条件下，才会启动降解程序。这项研究为新型可生物降解塑料的开发，提供了新的视角和方法，有望助力解决当下严重的塑料污染困境。
图7. 单螺杆挤出机制备“活”塑料，及其降解性能测试。(a)单螺杆挤出机制备得到的活体功能塑料；(b) 单螺杆制备活体功能材料的降解测试
中国科学院深圳先进技术研究院戴卓君研究员为论文通讯作者，戴卓君课题组联培博士唐琛望为论文第一作者，王林及孙静在实验设计、推进和文章修订中做出了重要贡献。该研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金优青及面上项目、广东省杰出青年自然科学基金等多个项目的支持。
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