Cell子刊：一类新的免疫刺激性dsRNA可抑制包括流感病毒和冠状病毒在内的一系列病毒

DNA是构成所有有机体基因组的双链分子，而RNA通常被描述为DNA的单链表亲。然而，许多类型的非生物病毒以双链形式的RNA（dsRNA）携带它们的遗传信息。当人类免疫系统检测到这种外来RNA的存在时，它通过增加称为干扰素（IFN）的保护性细胞因子的产生来发出警报，从而激活人体内针对病毒入侵者的先天免疫反应。

科学家们试图通过构建模拟病毒基因组特征的治疗性dsRNA来利用这种天然的抗病毒反应。但是对先天免疫系统的干预是一把双刃剑。病毒RNA类似物也可以激活导致体内过度炎症的分子途径，相比于它们的抗病毒益处，这可能造成更大的伤害。

如今，在一项新的研究中，美国哈佛大学怀斯生物启发工程研究所的研究人员发现了一类新的免疫刺激性dsRNA，它们能够强效地诱导两种形式的IFN---IFN-I和IFN-III---的产生，同时限制了以前使用基于RNA的免疫刺激剂通常观察到的炎症。相关研究结果近期发表在Molecular Therapy-Nucleic Acids期刊上，论文标题为“Self-assembling short immunostimulatory duplex RNAs with broad-spectrum antiviral activity”。

这些新的dsRNA分子极大地抑制了许多具有大流行潜力的病毒---包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV和多种甲型流感病毒毒株---感染人类细胞的能力，此外在传统的细胞培养物以及复杂的人类肺部器官芯片模型中都是如此。在COVID-19的小鼠模型中，dsRNA将它们体内的病毒载量减少了1000多倍。

论文共同第一作者Haiqing Bai博士说，“这些新的dsRNA对COVID-19来说是一种有吸引力的治疗选择，因为SARS-CoV-2感染产生了一种不平衡的免疫反应，其中保护性的IFN反应被抑制，而炎症反应却升高了。通过优先增加IFN-I，我们的dsRNA有潜力校正这种不平衡，也可能用于治疗许多其他病毒性疾病。”

偶然的发现，系统性探究

多年来，Bai和怀斯生物启发工程研究所创始主任Don Ingber实验室的其他成员一直在利用他们的人类器官芯片平台开发病毒性疾病的新疗法。在2020年之前，该团队正致力于确定人类肺细胞中调节它们对甲型流感病毒感染作出反应的基因，毕竟甲型流感病毒在当时是最值得关注的大流行病毒。他们首先使用CRISPR-Cas9筛选来确定可能抑制流感病毒增殖的宿主基因。筛选出的最佳候选基因之一是一个名为DGCR5的基因，它产生一种长链非编码RNA（lncRNA）序列，而不是一种蛋白。为了了解DGCR5如何影响感染率，他们设计出三种不同的干扰该基因表达的双链小干扰RNA（siRNA），然后将siRNA递送到体外培养的肺细胞中。

这些作者发现这种siRNA递送将DGCR5的水平降低了80%以上，并抑制了90%以上的甲型流感病毒感染。在这些结果的刺激下，他们开始单独测试这些siRNA，以及一些额外的针对DGCR5的siRNA序列。令他们吃惊的是，虽然他们构建的10种siRNA中的9种明显减少了DGCR5基因的表达，但其中只有一种抑制了病毒感染。看来，DGCR5的活性可能不是病毒感染率的驱动因素。

图片来自Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2022, doi:10.1016/j.omtn.2022.08.031。

当他们进一步开展研究时，他们证实这种特殊的siRNA导致参与IFN信号通路的多个基因的上调表达。额外的研究显示了这种siRNA专门激活了能触发IFN产生的三种信号通路之一，即RIG-I通路，该通路是先天免疫反应的一个重要组成部分。这些作者开始猜测他们发现了一类新的dsRNA，它们通过一种以前未知的作用机制刺激免疫系统。

他们开始系统地生成和测试这种原始的dsRNA序列的200多种变体，以找出这种机制。他们确定了一串特殊的核苷酸，称为“基序”，它始终存在于具有高IFN刺激活性的dsRNA的一端：一条链上的胞嘧啶（C）和另一条链上的三个鸟嘌呤（GGG）。鉴于C与这种基序中GGG序列的一个G结合，在每个dsRNA的末端有两个延伸出来的G。当dsRNA有许多拷贝时，从一个dsRNA分子的末端延伸出来的G可以通过一种叫做G-G胡斯坦碱基配对（Hoogsteen base pairing）的不寻常现象与从另一个dsRNA分子的末端延伸出来的G结合起来。由此产生的dsRNA二聚体直接与RIG-I非常有效地结合，导致RIG-I激活和随后的IFN反应。

论文共同第一作者Longlong Si博士说，“这对我们来说非常有趣，因为以前的研究已表明RIG-I可以被具有平齐末端（也就是没有从末端延伸出来的碱基片段）的双链dsRNA激活，而且几乎任何类型的末端延伸碱基片段（overhang）都可以阻止RIG-I的结合。但我们观察到的这种独特的G-G结合行为有效地产生了能强效激活RIG-I的具有平齐末端（blunt-ended）的dsRNA，所以在这种情况下，末端延伸碱基片段对我们的新型dsRNA的活性至关重要。”

从流感到COVID-19及其他

为了了解他们新发现的dsRNA在活细胞中的有效性，这些作者将其中的一种dsRNA与一种模拟病毒感染的合成免疫刺激剂poly(I:C)进行了面对面的测试。当他们将这两种化合物应用于人类上皮细胞时，他们发现这种dsRNA产生的抗病毒炎症反应较少，而具有更大炎症性的poly(I:C)在基因表达方面引起了更广泛的变化，并影响了对正常细胞功能至关重要的其他生物过程。

为了更进一步，这些作者随后在由怀斯生物启发工程研究所开发的用于在体外复制复杂的人类器官组织和功能的人类肺部气道和肺泡芯片中测试了这种dsRNA。他们将这种dsRNA引入健康芯片，观察到IFN-I的表达增加了12～40倍。当他们在器官芯片中加入甲型流感病毒时，他们发现这种dsRNA抑制了80%～90%的感染。

随后，COVID-19大流行来袭，这些作者将他们的研究从流感病毒转向SARS-CoV-2和相关的冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV和HCoV-NL63。他们的这种dsRNA从容应对了这种变化，对MERS-CoV和HCoV-NL63感染来自猴子的哺乳动物细胞系的抑制率超过90%，对SARS-CoV的抑制率超过1000倍。它还对SARS-CoV-2感染人类上皮细胞系的抑制率达到了惊人的99.99%。

最后，这些作者在COVID-19的小鼠模型中测试了这种dsRNA。当他们用SARS-CoV-2感染接受这种序列未受到破坏的dsRNA治疗的小鼠时，与用序列受到破坏的这种dsRNA治疗的小鼠相比，前者将小鼠肺部的病毒载量减少了1000多倍。

论文通讯作者、怀斯生物启发工程研究所教授Donald E. Ingber博士说，“COVID-19的大流行已经痛苦地表明，我们需要能够减弱各种病毒感染的广谱治疗方法，而不是在每种疾病出现时为它开发一种定制的治疗方法。我希望这种RNA治疗技术将成为对抗未来大流行病的一种广泛使用的方法。”

除了治疗病毒，这些新型dsRNA还可能用于治疗细菌、真菌和寄生虫感染，以及癌症和自身免疫性疾病等可以从增加IFN产生中获益的疾病。它们还可能被用作佐剂，以增强其他疫苗的活性。

这些作者说，未来的研究必须确定最佳的治疗时机，因为在感染中太晚激活IFN可能会加剧炎症，同时也要研究直接将dsRNA递送到上呼吸道（例如，通过吸入器）中以尽量减少全身性免疫激活的可能性。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Longlong Si et al. Self-assembling short immunostimulatory duplex RNAs with broad-spectrum antiviral activity. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2022, doi:10.1016/j.omtn.2022.08.031.