Nucleic Acids Research:开发出新型双碱基编辑器

基因单核苷酸变异（SNV）与基因功能密切相关。基于日渐普及的高通量测序技术，科研人员在动植物乃至人类基因组中发现大量SNVs。这些细微的基因差异中的部分已被证实与动植物的性状变异相关，也与人类遗传疾病的发生发展或药物疗效存在密切联系。目前，仍有大量SNV的功能尚未得到明确，揭示这些遗传变异与物种性状及临床表型间的关联，是农业分子育种和精准医学研究等领域向前推进时亟需解决的问题。

基因饱和突变文库是探究基因SNV功能的重要工具。利用基因编辑技术在基因特定区域中引入不同类型的碱基突变，并以其为基础进行功能性筛选，可以实现基因SNV功能的高通量研究。

近年来，基因突变文库构建主要借助CRISPR/Cas9系统在目标区域内引入移码突变破坏基因表达，从而根据表型鉴定基因功能。这种方式也可以诱导基因SNV的产生，但效率低下，不适合用于与基因SNVs相关的饱和突变文库的高效构建。科学家开发的碱基编辑器（BE）为饱和文库的构建带来了技术突破。BE系统可以在基因特定区域引入高效的单碱基转换，被迅速应用于与DNA损伤应答或癌症相关的基因SNVs功能的高通量筛选等研究中，并取得了突破性成果。现有的BE只能实现一种或两种类型的碱基转换，不能满足饱和突变文库对编辑产物多样性的需求，因此，亟需建立可以诱导多种类型碱基转换的基因编辑工具。

该研究将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和糖苷酶碱基编辑器（CGBE）结合，开发出新型的双碱基编辑器——AGBE。它可以利用单个向导RNA（sgRNA）诱导同一等位基因的靶序列单独或同时发生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4种不同类型的碱基转换。研究在永生化细胞系、原代细胞和胚胎细胞等多个哺乳动物的细胞体系中验证了AGBE系统的有效性。结果表明，与单独的ABE和CGBE相比，AGBE极大地拓宽编辑窗口（从4-8到3-13），在此基础上将不同类型的碱基转换进行组合，可以大幅度地增加编辑产物的多样性，从而构建出含有更多基因突变类型的突变文库。研究分析了全基因组和转录组测序数据，发现了AGBE不会引起明显的DNA或RNA水平的脱靶效应，证明了该系统是高效且安全的碱基编辑工具。

研究挑选了人类白喉毒素受体基因hDTR用于验证AGBE在基因饱和突变文库构建中的应用潜能。当hDTR基因发生突变时，会改变人类细胞对白喉毒素的敏感性，结合白喉毒素筛选和富集，可以快速获得具有白喉毒素抗性的突变文库，从而分析hDTR基因的SNV与药物敏感性间的联系。结果表明，在针对hDTR基因的关键功能域设计的32条sgRNA中，有20条可以赋予细胞抵抗白喉毒素的能力，产生了多达59269种不同类型的等位基因突变产物，并从中筛选出对白喉毒素有不同敏感性的突变细胞株。以上结果充分证实了利用AGBE系统进行基因SNVs功能高通量研究的可行性和高效性。

新型双碱基编辑器AGBE工作原理图