纳米孔长读长测序完成蜂鸟高度连续基因组组装并提高异构体识别

蜂鸟是一个“非常有趣的研究系统”，它具有惊人的糖氧化和脂肪分解能力，在进食状态下，它们能够利用外源糖，为能量消耗巨大的飞行提供燃料，然而当不再进食时，它们完全依靠内源性脂肪储备来为悬停飞行提供燃料，这些糖可以在30分钟内代谢。相比之下，人类需要大约2小时才能利用这些外源糖。

超过52%的美国人受到包括糖尿病在内的代谢疾病的影响，蜂鸟可以保持持续的高血糖水平，而没有任何眼、肝、肾或其他与人类糖尿病患者相关的问题。研究它禁食和进食状态之间的代谢通量可以帮助人们了解如何在不影响健康的情况下安全地保持如此高的血糖水平。

PromethION测序结合短读长测序从头组装高度连续准确的红喉蜂鸟基因组

利用纳米孔高通量测序仪PromethION，生成超过25 Gb的测序数据，N50大于40 Kb，结合短读长测序，使用由Aleksey Zimin和约翰·霍普金斯大学的Salzberg实验室开发的MaSuRCA工作流程进行基因组混合组装， “安娜的蜂鸟（Anna’s hummingbird）”作为参考基因组，用RAGOO进行参考引导的染色体Scaffold拼接：结果得到了1837个重叠群组成的33条染色体的组装，Scaffold N50 超过46.2 Mb。BUSCO组装完整性分数为96.6%，表明该组装不仅高度连续且高度准确，还非常完整。

使用PCR-cDNA测序试剂盒（PCR-cDNA Sequencing Kit，SQK-PCS109）对分离的添加poly-A尾的mRNA来进行文库制备，在纳米孔高通量测序仪PromethION上对3只进食后的蜂鸟和3只禁食蜂鸟进行cDNA测序，生成的长读长序列跨越整个异构体。利用短读长转录组数据进行基因组注释，用Augustus模型进行基因预测。识别出到47443个转录本和43908个基因，即每个基因约1.1个转录本。而结合纳米孔cDNA测序数据，并使用StringTie组装工具，识别出了73270个转录本，但基因数量相似——43278。这表明每个基因有约2个转录本。将纳米孔cDNA数据包含在内后，BUSCO转录组完整性也从90.1%提升到92.2%。

利用短读长测序数据对蜂鸟基因组进行差异基因表达分析，揭示参与脂肪酸通量调节的关键基因（如G0S2和ANGPTL4）在禁食和进食后的肝脏之间有表达差异。脊椎动物物种间直向同源基因的序列保守性展示出，G0S2与哺乳动物中的直向同源基因相比同一性非常低（< 50%）。

利用纳米孔cDNA测序数据，研究了组织之间的异构体表达差异，发现应激反应基因USP 15在肌肉细胞中转录水平更高，在肝脏和肌肉组织中的相对丰度不同。(生物谷Bioon.com）

【直播预告】纳米孔测序在人类遗传学和罕见病研究中的应用
【日期】2020/11/19 15:00
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