​《自然·遗传学》：人诱导多能干细胞曝重大隐患！剑桥团队发现，72%的人诱导多能干细胞DNA受到严重损伤

2006年，日本京都大学的山中伸弥团队将4种关键转录因子Sox2、Oct4、KLF4和c-Myc导入小鼠皮肤成纤维细胞中，获得了具有多能性的诱导多能干细胞（iPSCs）[1]。2007年，该团队又率先将该技术应用于人体细胞，获得了人诱导多能干细胞（hiPSCs）[2]。

iPSCs一经问世，便引起了轰动。具有多能性的干细胞从此能够在实验室中批量生产，在再生医学领域将是多么大的好消息啊！山中伸弥教授也因此于2012年获诺贝尔生理学或医学奖。这一开创性的工作从成果最初产生到获奖，时间间隔只有6年，在常常需要研究者比拼长寿的诺奖历史上，也属于获奖相当迅速的情况。

然而就在2015年，因在患者iPSCs中发现突变，首个将hiPSCs用于细胞治疗的临床试验仅进行至第二例便被叫停[3]。从此，笼罩在iPSCs头顶的这朵突变“阴云”，一直难以散去。近日，剑桥大学的Serena Nik-Zainal带领研究团队，结合全基因组测序（WGS）与全外显子组测序（WES），对hiPSCs的突变情况进行了大样本的全面研究，并探索了突变对hiPSCs功能的影响[4]。

他们发现，约72%的皮肤成纤维细胞来源iPSCs （F-hiPSCs）中，含有紫外线损伤相关的突变；而血液来源iPSCs（B-iPSCs）则有26.9%含有影响多能性的BCOR突变。

这项研究利用大样本测序数据，较为全面地绘制了hiPSCs的突变图谱。突变这么常见，若是不加筛选就将hiPSCs移植到患者体内，不但疗效可能受到影响，还可能给患者造成额外的伤害。这项研究提醒我们，移植前对hiPSCs进行遗传学检查很有必要。

hiPSCs的多能性与胚胎干细胞类似，却能够避免胚胎干细胞相关的伦理争议，并且移植受体可作为供体来源，能有效避免移植后的免疫排斥，在细胞治疗领域具有巨大的应用前景[5]；将hiPSCs在体外诱导分化形成特定组织、甚至类器官[6,7]，在体外建立疾病模型、筛选药物，有利于我们更好地理解疾病的病理生理变化、研究药物效果与治疗机制。

hiPSCs虽有万般好，短板在于对应的体细胞可能本身存在突变，在重编程、体外培养和传代的任一环节也可能引入突变，随之产生的致瘤性会使细胞治疗的安全性大打折扣。

要想将hiPSCs进一步应用于临床，就需要深入了解其中的突变规律，并明确这些突变究竟会如何影响hiPSC发挥治疗作用。

研究人员发现，不仅来自同一捐献者的F-hiPSCs突变数量要远多于B-hiPSCs，甚至在同一捐献者不同株的F-hiPSCs之间的突变也不尽相同。且F-hiPSCs的突变中，大部分与紫外损伤相关，可能由于对应的皮肤成纤维细胞先前存在日光暴露。B-hiPSCs的突变则与紫外损伤无关，而是具有氧化损伤的特点。

前面的数据虽然差异明显，但研究的样本量较少。这些差异究竟是普遍存在的现象，还是捐献者的个体差异造成的呢？

接下来，研究人员从HipSci干细胞库中选取了来自288名健康个体的452个F-hiPSCs细胞系，对它们的测序结果进行分析。结果显示，这些F-hiPSCs中有72%的细胞携带紫外损伤造成的突变，且突变负荷与捐献者年龄、性别均不相关。毕竟不管男女老少，谁都免不了晒太阳嘛。

F-hiPSCs内部的异质性也在大样本中得到了验证。即便是来自同一捐献者、在同一批次重编程的F-hiPSCs之间，也有很大的基因组差异。各株F-hiPSCs与对应的成纤维细胞在突变负荷上呈正相关。研究人员分析，可能是因为不同株的F-hiPSCs来自不同的克隆，而形成这些克隆的不同皮肤成纤维细胞之间，接受日光暴露的程度也有差异。看来防晒工作还是得面面俱到！

这些广泛存在的突变究竟会对hiPSCs产生什么影响呢？

研究人员将hiPSCs里的突变与COSMIC数据库中的癌症相关突变基因列表进行比对，发现与145个癌基因的272个突变重合。

考虑到紫外线损伤造成的突变占了很大一部分，这个看起来很可怕的数字里，可能也有许多属于对细胞选择性生长优势没有实质贡献的“乘客”突变 (passenger mutation)。于是研究人员进一步用生物信息学方法分析了基因、突变与选择压力间的关系，发现只有BCOR这个基因的正选择作用具有统计学意义。

本研究中的F-hiPSCs携带的BCOR突变均为可致病的截短突变，对应的成纤维细胞中却没有BCOR突变，所以研究人员推测，F-hiPSCs的BCOR突变很可能是在体外培养中产生的。

既然F-hiPSCs的BCOR突变看起来与紫外线暴露关系不大，那么类似的结论是否可以推广到B-hiPSCs中呢？

研究人员发现，B-hiPSCs携带BCOR突变的比例为26.9%，较F-hiPSCs更高。对应的体细胞和生殖系DNA样本也没有发现相同的BCOR变体。在B-hiPSCs中，研究人员发现了BCOR突变在后续体外培养时产生的直接证据：突变只存在于B-hiPSCs的亚克隆中，而亲代B-hiPSCs并不携带。这也进一步证实了BCOR突变的正选择压力。

将研究范围从众多的突变缩小到BCOR之后，研究人员将目光转向了它对hiPSCs多能性的影响，这是决定hiPSCs应用价值的关键一步。当研究人员试图诱导BCOR突变的B-hiPSCs向外胚层的代表——神经干细胞（NSC）分化时，发现它不但无法表达NSC特异性的分子标志物PAX6，而且比野生型的B-hiPSCs表达出了更高水平的中胚层分子标志物。至此，BCOR突变损害hiPSCs多能性的“罪证”终于坐实了！

研究人员另外还发现，长期的体外培养和多次传代，除了有利于BCOR突变发挥正选择作用，也有利于氧化损伤所致的体细胞突变累积。

总的来说，本研究通过分析大样本的测序数据，揭示了hiPSCs所含突变的共有规律；同时结合细胞功能实验，证实了筛选出的BCOR突变对hiPSCs功能的不利影响，为hiPSCs使用前的处理环节提供了新的意见：要警惕细胞系内部的异质性，注意克隆的选择；同时尽量避免长时间体外培养，以免突变累积。

遇到hiPSCs携带突变，也不必马上被吓倒。毕竟这项研究告诉我们，并非所有突变都与致瘤性直接相关，或许今后的研究能够更加明确地告诉我们二者的联系。

作为一篇生物信息学分析为主的论文，本研究中BCOR突变在B-hiPSCs较F-hiPSCs多见的现象，也值得在后续研究中进一步探究其背后的分子调控机制。

在当年的课堂上第一次听老师介绍iPSCs的研究过程时，奇点糕就在心里感慨，能想到用这个方法“人为制造”出多能干细胞的人，真是太聪明了！神奇的iPSCs从首次被制造出来直至今天，仍然没能实现从基础研究到临床应用的全面转化，因为新的治疗手段要想真正落地，安全性与有效性缺一不可。感谢样本保存技术和测序深度的进步，科学家们能够在hiPSCs应用到人体之前就发现这些隐患，未来的临床试验得以少一些惨痛教训。

我们真心期待在不久的将来，能有更加成熟、进步的培养和质检技术出现，促进hiPSCs的临床应用，让人类的智慧真正造福于人类。

参考文献：

[1].Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663-676. doi:10.1016/j.cell.2006.07.024

[2].Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-872. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019

[3]Garber K. RIKEN suspends first clinical trial involving induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):890-891. doi:10.1038/nbt0915-890

[4].Rouhani FJ, Zou X, Danecek P, et al. Substantial somatic genomic variation and selection for BCOR mutations in human induced pluripotent stem cells [published online ahead of print, 2022 Aug 11]. Nat Genet. 2022;10.1038/s41588-022-01147-3. doi:10.1038/s41588-022-01147-3

[5].Cyranoski D. Woman is first to receive cornea made from 'reprogrammed' stem cells [published online ahead of print, 2019 Sep 2]. Nature. 2019;10.1038/d41586-019-02597-2. doi:10.1038/d41586-019-02597-2

[6].Gabriel E, Albanna W, Pasquini G, et al. Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles. Cell Stem Cell. 2021;28(10):1740-1757.e8. doi:10.1016/j.stem.2021.07.010

[7].Koike H, Iwasawa K, Ouchi R, et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 2019;574(7776):112-116. doi:10.1038/s41586-019-1598-0