Chem：北京大学刘涛团队实现四嗪生物正交反应的超分子调控

生物正交化学反应是指能够在生物体系中进行、且不会与天然生物化学过程相互干扰的一类化学反应，它为科学家对生命进程的原位研究带来了革命性的技术, 已经成为化学生物学这一新兴交叉领域的核心方向之一，也因此于2022年获得诺贝尔化学奖。其中四嗪参与的生物正交反应——逆电子需求的Diels–Alder（IEDDA）反应，以其超快的反应速率、温和的反应条件和极好的生物相容性，被广泛应用于蛋白质的化学修饰以及生物医学的研究，对该反应的精确调控也具有着重要意义。

然而，目前的调控方式大多局限于光催化或电化学的手段，对生物体具有毒性，且操作不便。因此，对四嗪的反应活性进行简便、无毒且高效地调控，是是亟待解决的科学难题。

2023年6月15日，北京大学药学院刘涛教授课题组与南方科技大学蒋伟教授课题组在 Chem 期刊发表了题为：Reversible control of tetrazine bioorthogonal reactivity by naphthotube-mediated host-guest recognition 的研究论文。

在这项工作中，刘涛团队开发了一个非共价调控四嗪生物正交反应活性的策略，该方法简便高效且生物相容性好。该课题组之前发现超分子主体可识别蛋白表面以氨基酸侧链形式存在的客体，从而定点靶向蛋白质并影响其功能（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 11196），而蒋伟团队发现了超分子萘管可以与苯基嘧啶有高亲和力（CCS Chem. 2020, 2, 1078–1092）。因此，刘涛团队开发了超分子萘管识别四嗪并调控其生物正交反应活性的策略（图1）。该策略通过萘管主体与四嗪客体的分子识别来调控四嗪的生物正交反应活性。萘管能以高亲和力识别各种生物分子上的苯基四嗪，从而以可逆的方式有效地抑制它们的生物正交反应活性。这种策略有望扩展四嗪化学的应用。

图1：超分子萘管调控四嗪生物正交反应示意图

1、实现四嗪生物正交反应在多种生物大分子上的可逆调控

理论计算及实验均验证了萘管能与苯基四嗪有高亲和力，并且该结合能够有效抑制四嗪的反应活性。这种分子识别对于不同的分子上修饰的四嗪都十分有效，包括荧光分子、糖、氨基酸、核酸和蛋白质。并且，被包笼四嗪的反应活性可以通过加入与萘管有高亲和力的竞争性小分子实现恢复（图2）。

图2：实现四嗪生物正交反应在多种生物大分子上的可逆调控

2、顺序IEDDA反应的策略实现抗体精准多位点修饰及抗体药物荧光双偶联

通过将四嗪做成氨基酸侧链的形式，四嗪氨基酸可以被基因编码、参与蛋白质的翻译，实现对蛋白质的定点四嗪修饰。而通过理论计算与实验测定，萘管只能识别在蛋白表面充分暴露在溶剂中的“站式”四嗪氨基酸，而不能识别贴在表面的“躺式”四嗪氨基酸，而二者本身都具有生物正交反应活性。因此，可通过先对“站式”四嗪氨基酸的包笼，让“躺式”四嗪氨基酸先进行生物正交反应，然后通过竞争性小分子的加入，让“站式”的四嗪氨基酸参与新的分子介导的生物正交反应。这种顺序IEDDA反应可以实现在插入多个四嗪氨基酸的蛋白质中进行快速定点的生物正交反应多修饰。

鉴于抗体药物偶联物（Antibody-drug Conjugates，ADC）广泛应用于临床治疗，且因抗体蛋白稳定性差，温和快速的IEDDA反应十分适用于制备抗体小分子偶联物。因此这样的顺序IEDDA反应首先应用于对于抗体的温和快速多标记。通过表达包含多个四嗪氨基酸的抗体并进行顺序IEDDA反应，刘涛团队制备了定点修饰的长效荧光抗体以及荧光抗体药物偶联物，且表征了其生物活性（图3）。

图3：顺序IEDDA反应的策略实现抗体精准多位点修饰及抗体药物荧光双偶联

3、顺序IEDDA反应实现活细胞多靶点高效成像

四嗪IEDDA反应由于其温和快速的特点，被广泛应用于活细胞的标记。而超分子调控元件也具有极好的生物相容性。通过细胞自身表达多种含四嗪氨基酸的蛋白，顺序IEDDA反应可以实现对同一活细胞内多种蛋白迅速且温和的定点修饰与标记（图4）。

图4：顺序IEDDA反应实现活细胞多靶点高效成像

4、小鼠活体内实现四嗪生物正交反应活性的可逆调控

四嗪IEDDA反应速率很高，且反应条件温和，这使得它可以用于活体内的反应。因此，本文也进行了在活体内调控四嗪生物正交反应活性的实验（图5）。

图5：小鼠活体内实现四嗪生物正交反应活性的可逆调控

该工作开发了一种基于超分子主客体识别的四嗪生物正交反应活性调控策略，该策略通过萘管主体与四嗪客体的分子识别来调控四嗪的生物正交反应活性。萘管能以高亲和力识别各种生物分子上的苯基四嗪，从而以可逆的方式有效地抑制它们的生物正交反应活性。这种调控方式对于一系列包含四嗪的生化分子以及复杂环境下仍然适用。并且通过顺序IEDDA反应的策略，该调控体系可用于制备定点修饰的长效荧光抗体以及荧光抗体药物偶联物、对同一活细胞内多种蛋白迅速且温和的定点修饰与标记。这种策略生物相容性好，操作便捷，有望扩展四嗪化学的应用。

北京大学药学院刘涛教授为论文通讯作者。南开大学联合培养2015级博士生（已毕业）曹文兵、北京大学药学院2018级六年制学生王浩宇、深圳大学材料学院副研究员权茂为论文共同第一作者。团队成员李雨轩、苏晔宇、李雨航，南方科技大学蒋伟教授，天然药物及仿生药物国家重点实验室平台指导老师张晓辉和师晓萌以及北京大学医学部实验动物科学部指导老师赵祎洁也对该工作做出了重要贡献。