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CD137-CD137L信号通路通过Rab7分子调控自噬影响小鼠血管平滑肌细胞外泌体分泌

来源:中华心血管病杂志 2020-05-14 12:39

 

自噬是公认的细胞内废物降解的基本机制,细胞内自噬小体隔离多余、老化或受损的细胞质并将其输送至溶酶体降解。正常情况下,自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体进而降解清除底物,当自噬流受阻时,未被溶酶体降解的自噬小体蓄积,其去向目前仍不明确。

为了探讨CD137-CD137配体(CD137L)信号通路是否通过Rab7分子调控自噬从而影响小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)外泌体的分泌, 江苏大学附属医院何阳, 崔星刚, 李波, 等人采用组织块贴壁法原代培养C57BL/6J小鼠胸主动脉平滑肌细胞,取分离培养的第3~5代的VSMC进行实验。实验分为4组,即对照组、CD137激动组(采用10 μg/ml的CD137L重组蛋白激动CD137-CD137L信号通路)、慢病毒对照组(在CD137L重组蛋白干预的基础上加对照干扰慢病毒干预)和Rab7慢病毒干扰组(在CD137L重组蛋白干预的基础上加Rab7干扰慢病毒干预)。Western blot法检测各组VSMC微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、p62和Rab7的蛋白表达。自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)荧光显微镜下观察各组VSMC自噬流的变化。透射电镜下观察VSMC来源外泌体的形态及大小,Western blot法检测外泌体标记物CD9、CD81和热激同源蛋白70(Hsc70)以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达,纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测各组VSMC分泌的外泌体的浓度。

结果发现:各组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和P62的蛋白表达水平:CD137激动组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达水平均明显高于对照组(P均<0.05)。Rab7慢病毒干扰组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达均低于CD137激动组(P均<0.05)。慢病毒对照组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达与CD137激动组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。各组VSMC自噬流的变化:CD137激动组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均多于对照组(P均<0.05),且CD137激动组VSMC内黄色荧光点数多于红色[分别为(50.3±0.9)和(10.3±1.5)个/细胞]。而Rab7慢病毒干扰组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均少于CD137激动组(P均<0.05),且Rab7慢病毒干扰组VSMC内红色荧光斑点数多于黄色[分别为(40.7±4.0)和(10.7±1.2)个/细胞]。慢病毒对照组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数与CD137激动组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

小鼠VSMC来源的外泌体的鉴定、外泌体标记物CD9、CD81的表达以及各组VSMC外泌体浓度和自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达:透射电子显微镜下观察,分离和纯化的小鼠VSMC分泌的外泌体为直径30~150 nm的囊泡状结构。Western blot结果显示,在纯化的外泌体中检测到外泌体标记物CD9、CD81蛋白的高表达。NTA技术检测结果示,CD137激动组VSMC外泌体浓度明显高于对照组(P<0.05);Rab7慢病毒干扰组VSMC外泌体浓度明显低于CD137激动组(P<0.05);慢病毒对照组VSMC外泌体浓度与CD137激动组比较差异无统计学意义(P>0.05)。CD137激动组VSMC外泌体中Hsc70蛋白表达高于对照组(P<0.05);Rab7慢病毒干扰组VSMC外泌体中Hsc70蛋白表达低于CD137激动组(P<0.05);慢病毒对照组VSMC外泌体中Hsc70蛋白表达水平与CD137激动组比较差异无统计学意义(P>0.05)。CD137激动组VSMC外泌体中LC3Ⅱ的表达水平高于对照组(P<0.05),Rab7慢病毒干扰组低于CD137激动组(P<0.05),慢病毒对照组与CD137激动组比较差异则无统计学意义(P>0.05)。

CD137-CD137L信号通路可能通过Rab7分子调控自噬进而影响小鼠血管平滑肌细胞外泌体的分泌。(生物谷Bioon.com)

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